干細胞治療卵巢早衰的實驗研究進展

劉 煒，周 圍，童曉文，紀亞忠

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學科，上海 200065)

卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)是指女性在40歲之前，除妊娠外，閉經(jīng)4個月或以上，卵泡期血液檢查不少于2次(間隔不少于30 d)顯示血清卵泡刺激素(FSH)＞40 U/L、雌二醇(E2)＜73.2 pmol/L。POF在40歲之前的發(fā)病率為1/100，30歲之前為1/1000，20歲之前為1/10000，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。POF在臨床上并不少見，其中在原發(fā)閉經(jīng)者中占10% ～28%，繼發(fā)閉經(jīng)者中占4% ～18%［1］。POF患者雌激素水平低下，可出現(xiàn)情緒不穩(wěn)定、抑郁、煩躁、月經(jīng)失調(diào)、性欲減退、不孕等相關癥狀。干細胞移植是目前國內(nèi)外學者研究較多的治療疾病的一種新方法，且已在多種疾病治療中取得成功［2，3］?，F(xiàn)將干細胞移植治療POF的實驗研究進展做一綜述。

1 POF的治療現(xiàn)狀

目前查閱到的POF治療措施主要包括心理治療、中醫(yī)治療和西醫(yī)治療三類途徑。心理治療可作為POF的輔助治療，因月經(jīng)周期變化受下丘腦—垂體—卵巢軸的調(diào)節(jié)，所以環(huán)境、營養(yǎng)、心理等因素均可對此性腺軸產(chǎn)生影響。曹麗英等［4］認為，藥物結(jié)合心理疏導治療的療效明顯好于單純藥物治療。中醫(yī)認為本病的發(fā)病與腎虛密切相關，雖然治療方法不統(tǒng)一，但所用驗方基本是在古方的基礎上改進或者加入西藥成分形成。相關文獻表明，針對所有類型 POF的中醫(yī)復方治愈率為 33.33%［5］～43.59%［6］。西醫(yī)治療POF的經(jīng)典方案為補充性激素，即雌、孕激素周期治療和連續(xù)治療［7］。陳捷等［8］采用本方法治療40例POF患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)閉經(jīng)時間1 a內(nèi)的患者治療相對有效，而對于閉經(jīng)時間大于1 a的患者雖然治療后血清FSH水平下降、E2水平升高，但與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義。李靈等［9］回顧性分析了33例采用本方法治療的POF患者，治愈3例、有效11例、無效19例(57.6%)。

對于卵巢血管因素導致的POF患者，可以在卵巢功能喪失怠盡前盡早行血管搭橋手術［10］;另外，還有國外文獻提出了基因治療［11］和免疫學病因治療［12］，但均未見突破性進展。故目前尚無有效治療POF的根本方法。

2 干細胞與再生醫(yī)學

近年來干細胞移植已成為治療POF的治療熱點之一，并在實驗室研究中取得一定成就。廣義上講，再生醫(yī)學是一門研究如何促進創(chuàng)傷與組織器官缺損生理性修復以及如何進行組織器官再生與功能重建的新興學科，其主要通過研究干細胞分化以及機體的正常組織創(chuàng)傷修復與再生等機制，尋找促進機體自我修復與再生，并最終達到構(gòu)建新的組織與器官以維持、修復、再生或改善損傷組織和器官功能之目的［13］。

干細胞被認為是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，分為胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成體干細胞(Adult stem cells，ASCs)。ESCs是來源于人和哺乳動物早期胚囊內(nèi)細胞團中的一種二倍體細胞，具有全能分化性，其優(yōu)點為可體外培養(yǎng)無限增殖、具有自我更新的能力及多向分化的特性。ASCs是成體組織中保留的未完全分化的原始細胞，目前已經(jīng)在多種組織器官中被發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)點為獲取相對容易，源于患者自身的ASCs在應用時不存在組織相容性的問題，理論上致瘤風險很低、所受倫理學爭議較少，且具有多向分化潛能［14］。以往研究認為ASCs只能分化為其組織器官的細胞類型，但近幾年的有關研究［15，16］正在改寫這一觀點。例如來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs)亦屬于 ASCs［17～19］，因其來源廣泛、獲取容易、擴增能力強、免疫原性低、非致瘤、能歸巢、無醫(yī)學倫理學爭議等優(yōu)點而成為再生醫(yī)學、細胞療法中的主要選擇細胞。

3 干細胞治療POF研究開展的有利條件

3.1 卵巢生殖細胞恒定論已被打破 哺乳動物出生后卵泡不再更新，卵巢中不存在生殖干細胞的卵巢生殖細胞恒定論的觀點來自于Zuckerman通過長達20年的研究(于1951年發(fā)表了具有里程碑意義的論文)，此觀點一直以來被人們廣泛接受。直到2004年Johnson等發(fā)起了對此觀點的挑戰(zhàn)，他們認為出生后的小鼠卵巢中有生殖干細胞，卵巢中有卵泡再生［18］。近幾年的研究中，越來越多的證據(jù)傾向于支持卵巢中存在生殖干細胞的觀點。

3.2 各種POF動物模型成功建立 POF病因及發(fā)病機制目前尚未完全清楚。特發(fā)性 POF占高促性腺激素性閉經(jīng)者的81%，是POF最常見的類型，其他類型的POF涉及遺傳、免疫、代謝異常、放療化療因素、感染因素、醫(yī)源性因素及心理因素等［19］。建立理想的動物模型有利于更好地探尋治療POF的方法?，F(xiàn)已構(gòu)建的POF模型主要有:應用免疫相關因素構(gòu)建的模型［應用粗制的卵巢抗原、透明帶(ZP)抗原或純化透明帶ZP3抗原免疫動物獲得］;切除初生小鼠胸腺建立有自身免疫卵巢炎的小鼠模型;基因敲除建模［敲除連接蛋白37(Cx37)基因生長分化因子-9(GDF-9)、Bcl-2等方法］;針對酶缺陷所致半乳糖血癥建立的半乳糖血癥小鼠動物模型;物理化學因素［去氧乙烯基環(huán)己烯(VCD)、順鉑、環(huán)磷酰胺(CTX)、白消安和放射線)］所致卵巢損傷模型;臨床藥物損傷［高促性腺激素、雷公藤多甙片］所致卵巢損傷模型［20］。

3.3 干細胞移植在臨床成功應用 對造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSC)的研究始于20世紀60年代，目前其已成為研究得最為清楚、應用最為成熟的ASCs。通過移植HSC治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的方法早已在臨床廣泛開展，并且成為常用治療手段;對于其他系統(tǒng)惡性腫瘤、自身免疫病和遺傳性疾病等其他疾病的治療也取得了令人矚目的療效。以上科研成果為干細胞移植治療POF、卵巢損傷的研究奠定了基礎，促使此項技術更快地發(fā)展。

4 干細胞治療POF的實驗研究

4.1 放療、化療所致POF 多數(shù)研究者認為，化療藥物引起的卵巢損傷與卵母細胞及顆粒細胞凋亡密切相關［21］。2005 年，Johnson 等［22］將健康成年小鼠的骨髓，經(jīng)尾靜脈移植至經(jīng)環(huán)磷酰胺和白消安處理后喪失了生殖細胞的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些小鼠卵巢中有卵泡生成。2008年Fu等［23］研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)經(jīng)腹腔移植同樣可以提高卵巢功能，修復化療后卵巢結(jié)構(gòu)的損傷:具體方法是建立兔磷酰胺氮芥卵巢損傷模型，將標記的BMMSCs經(jīng)腹腔注射到兔雙側(cè)卵巢，在移植后2、4、6、8周處死兔，通過其動情周期、性激素水平變化、卵泡計數(shù)、顆粒細胞凋亡情況及相關凋亡因子Bcl-2、Bax評價卵巢功能情況。付霞霏等［24］也進行了類似實驗，其認為BM-MSCs移植可修復CTX損傷的卵巢組織，部分改善卵巢內(nèi)分泌功能。李彩霞等［25］采用白消安、CTX和放射線構(gòu)建了更貼近臨床放化療損傷的小鼠POF模型，并經(jīng)尾靜脈向小鼠移植人類臍帶充質(zhì)干細胞(US-MSCs)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC-MSCs可向POF小鼠卵巢歸巢并能在局部存活生長，提示UCMSCs可能具有卵巢損傷修復作用。黨建紅等［26］將人臍血單個核細胞(HCMNCs)經(jīng)卵巢注射至由放射線構(gòu)建的小鼠POF模型體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCMNCs可在早衰卵巢中存活并參與卵巢功能的修復，E2、FSH、LH水平明顯改善，卵巢切片示未閉鎖卵泡數(shù)有所增加、可見各個發(fā)育階段卵泡。

4.2 原發(fā)性POF 此類疾病特點是女性核型異常、閉經(jīng)和不孕，伴FSH受體(FSHR)基因突變導致的FSH升高、雌激素水平降低。Ghadami等經(jīng)靜脈向FSH受體敲除雌鼠(FORKO小鼠)移植BM-MSCs后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ORKO小鼠的總體質(zhì)量和生殖器官體積明顯增大，卵巢HE染色顯示總卵泡數(shù)及成熟卵泡數(shù)明顯增加，與對照組比較，被移植動物的血清FSH值下降40% ～50%、雌激素水平增加4～4.5倍，在卵巢中可檢測到FSHR mRNA。此提示經(jīng)靜脈注射的BM-MSCs能夠到達FORKO小鼠的卵巢，可分化并表達為FSHR基因，使FSHR對FSH做出響應，從而促進雌激素分泌和排卵恢復。

4.3 卵巢自身免疫應答所致POF 近年研究顯示，卵巢自身免疫應答可引起POF，并影響正常生育。自身免疫性卵巢疾病以及利用卵巢抗原作為免疫避孕疫苗引起的卵巢免疫損傷是導致POF的一個重要原因。李威娜等將BM-MSCs經(jīng)腹腔移植至豬卵巢蛋白免疫損傷小鼠模型卵巢內(nèi)，移植后按既定時間處死小鼠，利用PCR技術檢測卵巢中GFP基因(來自GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的 BM-MSCs)以判斷BMMSCs是否到達卵巢，通過對卵巢組織切片HE染色以及細胞凋亡分析檢測BM-MSCs是否對免疫損傷卵巢有修復作用及其機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BM-MSCs可直接到達免疫損傷卵巢并促進免疫損傷卵巢組織修復，其機制可能與減少顆粒細胞凋亡有關。

4.4 理化因素所致POF VCD為4-乙烯基環(huán)己烯(VCH)的代謝產(chǎn)物，是生產(chǎn)橡膠、塑料、殺蟲劑、滅火劑等過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。以往研究顯示，VCD能夠破壞原始及初級卵泡，其機制為加速卵泡自然閉鎖進程，使成熟卵泡正常排卵后無新的卵泡募集補充，最終導致雌性小鼠卵巢卵泡耗竭，引起卵巢功能衰竭［27］。王琰等利用 VCD誘導建立小鼠POF模型，經(jīng)卵巢移植健康小鼠的骨髓MSCs，移植后定時取血液標本及卵巢組織，同時觀察小鼠動情周期變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs可改善小鼠的卵巢內(nèi)分泌功能，且能長時間存在于卵巢組織中。

對于雷公藤引起的卵巢早衰和過氧化氫引起的卵巢損傷，也有研究者進行了干細胞移植實驗，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)干細胞移植可促進卵巢功能恢復。

上述干細胞移植的基礎研究和臨床探索為POF治療開辟了一條嶄新的道路。但是，在真正將這種方法用于臨床POF患者治療前，還有很多工作要做。首先，要選擇合適的供體細胞。ASCs因具有取材方便、來源廣泛、免疫原性弱等優(yōu)點成為理想的干細胞來源，但目前掌握的研究資料不多，有待繼續(xù)深入研究。其次，應選擇合適的移植方案以保證臨床收益最大。需要考慮的因素包括移植細胞的保存方式、移植數(shù)量、靶點選擇、免疫抑制劑的應用等。再次，應確保移植的安全性。李彩霞等［25］在實驗中觀察到接受移植的14只小鼠中有2只小鼠死亡，死亡原因尚不明確;其他小鼠在細胞移植后出現(xiàn)一過性精神萎靡、攝食差等變化，1 d左右好轉(zhuǎn)。其他研究中對移植后動物的觀察較少。為確保臨床被移植患者的安全，預計可能出現(xiàn)的毒副反應以及并發(fā)癥是必須要做的前期研究?？傊?，未來有可能通過干細胞移植促進POF患者卵巢功能恢復及有生育要求的患者自然受孕。

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