幾種榆屬植物組織培養(yǎng)研究進展

李 雯，王秀華

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040)

榆樹，雙子葉植物，樹皮粗糙，具實用及藥用價值，主要用于造林、綠化;榆樹嫩果和幼葉可以食用或作飼料，同時可入藥等。榆屬常見樹種為白榆、春榆、脫皮榆和黃榆等，其適應(yīng)性極強，喜光、耐寒、耐旱、耐瘠薄，不擇土壤［1］;根系發(fā)達，抗風(fēng)力、保土力強;萌芽力強，耐修剪;生長快，壽命較長。

近年來，隨著對榆樹研究的發(fā)展和深入，傳統(tǒng)的育種工作受到了分子生物學(xué)等最新研究成果的沖擊，國內(nèi)外許多研究已轉(zhuǎn)向遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究［2－4］，但有一系列問題尚未解決，本文總結(jié)榆屬常見樹種組織培養(yǎng)近況，討論不同培養(yǎng)基及激素對其愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根的影響，獲得高效率的外植體再生體系，為今后榆樹基因工程改良作物提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。

1 材料的選取與處理

1.1 材料的選取

組織培養(yǎng)的選材很重要，會直接影響實驗效果。外植體的選材應(yīng)充分考慮取材部位、大小和供體植株的生理狀況等因素，因為植物細胞具有全能性，理論上講選用植株的任何部位都能誘導(dǎo)成株，但是實驗表明，植株的不同部位誘導(dǎo)結(jié)果還是有很大差別的，因此在選取外植體時應(yīng)挑選誘導(dǎo)能力強的，如幼葉、莖段、莖尖和腋芽［5］等。

榆樹組織培養(yǎng)材料選取通常有兩種途徑［6］:一種是直接取自野生植株不同部位作為外植體。另外一種是利用榆樹種子萌發(fā)，然后取無菌苗的不同部位作為外植體，第二種方法的優(yōu)點是減少了外植體染菌的機率，提高了實驗效率。

1.2 材料的采摘與處理

實驗如果選取野生植株作為外植體，盡量選取植株生長旺盛且氣溫較涼爽的季節(jié)，通常4～5月份取材比較適宜。如王靜華、侯建生等人取白榆當年生健壯帶芽莖段［7］;圖亞等人取黃榆的葉片［8］;林靜芳取春榆樹冠中部新梢切斷作為外植體材料［9］，通常剪成2㎝左右長，先對材料進行預(yù)處理，用洗衣粉清洗其表面灰塵及部分菌體，再用自來水沖洗30～45 min。然后將清洗后的外植體在超凈工作臺上，用75%酒精浸泡30 s，2%次氯酸鈉消毒液浸泡3～5 min，無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸去水分，接種于激素濃度合適的基本培養(yǎng)基上，其中滅菌時間要根據(jù)材料的不同適量調(diào)整，時間短易造成材料消毒不充分而致初代培養(yǎng)時污染率高，時間過長則可能造成外植體的黃化和褐化。

實驗如果選取種子進行萌發(fā)，在當年5～6月間，當榆樹的果實由綠色變?yōu)辄S白色、中部隆起即可采收，種子質(zhì)量應(yīng)達到GB7908林木種子質(zhì)量分級規(guī)定的I級和II級標準［10］，放于通風(fēng)處自然陰干，隨采隨用，同樣用洗衣粉清洗其表面，再用自來水沖洗3～5 h。然后將清洗后的種子在超凈工作臺上，用75%酒精浸泡1 min，5%次氯酸鈉消毒液浸泡8～10 min，無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸去水分，接種到不添加任何激素的基本培養(yǎng)基上，待其長出無菌苗即可取材實驗。

2 培養(yǎng)基的選擇與激素調(diào)節(jié)

2.1 培養(yǎng)基的篩選

植物組織培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)成分全部來自培養(yǎng)基，其供應(yīng)狀況直接關(guān)系到培養(yǎng)物的生長與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點及其配制至關(guān)重要。通過眾多人實驗，如圖亞通過對蒙古黃榆的愈傷組織誘導(dǎo)過程中的比較發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率明顯比LP、DCR培養(yǎng)基高，且愈傷產(chǎn)生的情況及生長狀況也較優(yōu)［11］;張建鋒、彭冶、唐曉杰、林靜芳等人通過實驗對比發(fā)現(xiàn)，白榆、金葉榆和春榆等的最適增殖培養(yǎng)基也為 MS 和 1/2MS 培養(yǎng)基［9，12－14］。因此榆樹組織培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基為MS，培養(yǎng)基加蔗糖20 g/l，瓊脂6.5 g/l，附加不同的濃度及不同種類的激素。

2.2 激素種類及濃度的影響

激素在植物組織培養(yǎng)中起著關(guān)鍵作用，因此正確的選擇適合的激素及對激素使用量的控制很重要。

2.2.1 激素種類

從榆屬常見樹種的組培結(jié)果來看，增殖培養(yǎng)基通常為MS+6－BA+IBA，6－BA可以高效的從頂芽、側(cè)芽和莖段誘導(dǎo)芽增殖。具體要根據(jù)材料地域不同進行試驗;最適的生根培養(yǎng)基通常為MS或者1/2 MS+IBA，從生根率看，MS普遍比1/2MS效果好，在葉片、胚軸作為外植體誘導(dǎo)不定芽時，TDZ通常比6－BA誘導(dǎo)率高;2，4－D，KT等激素也被用于榆樹組培中，但是誘導(dǎo)效果不明顯，被證明不適合榆屬組織培養(yǎng)，在黃榆、春榆的生根培養(yǎng)中，添加NAA有利于生根率的提高，但是在白榆的培養(yǎng)基中添加NAA很容易玻璃化，生根率低，是否因為白榆對NAA比較敏感沒有具體研究。另外通常往培養(yǎng)基中添加少量的赤霉素來防止小植株基部形成愈傷組織而導(dǎo)致成活率下降［15］。

2.2.2 激素濃度配比范圍

經(jīng)王靜華等人實驗證明，最適白榆增殖培養(yǎng)基是MS+6－BA 0.10mg/l+IBA 0.005mg/l，同時其也添加少量NAA，但是白榆極易產(chǎn)生玻璃苗。最適生根培養(yǎng)基是MS+IBA 0.01mg/l;葉片再生最適培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.005mg/l+IAA 0.005mg/l，但是葉片再生能力較弱，有待進一步研究［16］。杜盛等人經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)最適合脫皮榆的增殖培養(yǎng)基為MS+(1.5 ～2.0)mg/l BAP+0.01mg/l NAA［17］;唐曉杰在對金葉榆組培中證明，MS+6－BA 1.0mg/l+IBA 0.1mg/l培養(yǎng)基中不定芽增殖數(shù)量最多［14］。

綜上，增殖培養(yǎng)基通常濃度配比范圍為6－BA(0.1～2.0)mg/l，IBA(0.005 ～0.1)mg/l，具體要根據(jù)材料地域不同進行試驗，選取合適的濃度范圍進行培養(yǎng);最適的生根培養(yǎng)基IBA通常濃度范圍(0.01～1.0)mg/l，IBA濃度增加，根會變粗壯，但當IBA濃度超過1.0mg/l時，就會抑制根伸長，有毒物質(zhì)積累，出現(xiàn)瘤狀物，因此要根據(jù)具體材料調(diào)節(jié)濃度。

3 組織培養(yǎng)中的其他影響因素

3.1 溫度 光照的影響

研究表明，榆樹培養(yǎng)室溫度應(yīng)控制在25±2℃，溫度過高不利于生長，容易長菌;溫度過低，不利于光合作用。光照強度2000～3000 Lx，光照時間為10 h［7］，同時配合8～10 h的暗處理對初始誘導(dǎo)有更好的效果，因為愈傷組織最初出現(xiàn)芽體需在黑暗中培養(yǎng)［18］，然后再光下進一步培養(yǎng)產(chǎn)生大量芽體，具體時間還要根據(jù)材料靈活選擇。

3.2 pH的選擇

榆樹最適pH為5.8～6.0，符合其野外生長土壤環(huán)境，微酸性環(huán)境下幼苗生長有利，存活率較高。同時在配置培養(yǎng)基時，要充分考慮到滅菌前后pH變化而進行調(diào)試，防止因為滅菌過后pH降低，影響培養(yǎng)基質(zhì)量。

3.3 培養(yǎng)基中的C/N

培養(yǎng)基中蔗糖，為培養(yǎng)物的生長發(fā)育提供所需的能量和底物，同時也影響植物的滲透勢;反過來，培養(yǎng)基的滲透勢也對培養(yǎng)物的代謝起調(diào)節(jié)作用。

李天珍、李保堂等人通過對白榆新稍生根的研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基的蔗糖濃度較低時，根系的發(fā)生主要受能量和底物供給的限制，滲透勢的調(diào)節(jié)則處于次要地位，隨著蔗糖濃度的提高，能量和底物的供給達到飽和，這時蔗糖濃度再進一步提高，起到了調(diào)節(jié)滲透勢的作用，同時促進生根。在培養(yǎng)基中加入NO3－或NH4+作為氮源時，在測試范圍內(nèi)對生根有抑制作用，降低新稍的生根率。結(jié)果表明，含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基比低濃度蔗糖的培養(yǎng)基生根率高。即C/N比高有利于生根［19］。

因此在生根實驗中，應(yīng)特別注意在合適范圍內(nèi)適當提高C/N比，高濃度的蔗糖有利于提高生根率。

4 白榆組織培養(yǎng)的生根問題

4.1 試管內(nèi)生根

實驗證明，王靜華在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中也可以讓白榆生根但生根率較低，添加IBA后更適合生根，且平均莖高、平均根長、生根率和生根系數(shù)均高于不添加任何激素的培養(yǎng)基［7］。將長勢較好的試管苗接種，待新稍長到30～40 mm左右時，如唐曉杰等在金葉榆試管苗長出3～5條不定根，根長1.5 cm時［14］，在培養(yǎng)室內(nèi)打開培養(yǎng)瓶口煉苗2～3 d，煉苗過程需注意補水，防止幼苗缺水干枯。

4.2 試管外生根和移栽

煉苗結(jié)束后取出植株，洗凈根上的瓊脂，在10%多菌靈溶液中浸泡15～20 min后扦插到裝有蛭石+珍珠巖+草炭土=1∶1∶1的花盆中，因為蛭石和珍珠巖透水透氣性好，而草炭土能提供充分的營養(yǎng)，此基質(zhì)組合為最佳［11］。開頭3～5 d暗處理，以后逐漸增加光照，不斷澆水，15～20 d左右檢查，看生根情況，進行統(tǒng)計生根率和成活率。

組織培養(yǎng)中試管內(nèi)生根有一定的弊端，生根不旺盛，容易感染雜菌，移栽過程中容易死亡，導(dǎo)致移栽存活率較低。因此試管外生根將試管苗生根和馴化結(jié)合起來，大大提高了繁殖系數(shù)，有利于大規(guī)模培養(yǎng)。

5 展望

組織培養(yǎng)由于具有縮短育種時間、提高植物品質(zhì)以及保存物種等優(yōu)點，已經(jīng)在很多植物中獲得成功。近些年來，通過對不同外植體的誘導(dǎo)已經(jīng)獲得了不同種榆的再生植株，但是榆樹的組織培養(yǎng)體系并不是完全成熟，存在一些急需解決的問題:比如在組培過程中，外植體經(jīng)常存在褐變現(xiàn)象，有研究稱褐變主要是PPO作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的，因此在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和其他抑制劑可以抑制褐變［20］，陳學(xué)森等在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用植酸作抗氧化劑，取得了一定成效［21－23］。但是具體的是否適用于榆樹組培還有待進一步研究;在繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)玻璃化苗、白化苗等現(xiàn)象的具體原因以及克服方法也還沒有明確的研究。

因此在愈傷組織分化時，根據(jù)內(nèi)源激素的要求，在培養(yǎng)基中添加合適的外源激素來進行調(diào)節(jié)，從再生角度考慮，繼續(xù)擴大基因型篩選范圍，尋找對再生敏感的基因型［17］是今后努力的方向，相信通過不懈努力，榆樹的組織培養(yǎng)工作將會取得更大的成績，使其綜合利用價值更高。

［1］周以良.黑龍江省植物志(第四卷)［M］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社，1992.

［2］ Santamour F S.Interspecific hybridization with in fall and spring flowering［J］.Forest Science，1972，18:283 － 289.

［3］ Kamalav J C，Carey D W.Application of RAPD PCR markers for identification and genetic analysis of American Elm(Ulmus amer icana)selection［J］.Journal of Environmental Horticulture，1995，13(4):155－159.

［4］ Kapaun J A，Cheng Z M.Plant regeneration from leaf tissues of Siberian elm［J］.HortScience，1997，32(2):301 －303.

［5］ 張 健，王 穎，吳坤鑫，等.白木香組織培養(yǎng)研究進展［J］.中國園藝文摘，2011(6):42－44.

［6］張在盛，王秀華.越桔組織培養(yǎng)的相關(guān)研究［J］.森林工程，2011，27(6):23 －25.

［7］王靜華，侯建生，劉桂林，等.白榆的組織培養(yǎng)與葉片再生研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2009，24(5):74 －77.

［8］圖 亞，葉冬梅，張文泉，等.蒙古黃榆愈傷誘導(dǎo)及植株再生的初步研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，33(1):38 －42.

［9］林靜芳，董茂山，黃欽才.春榆組織培養(yǎng)苗移植成功［J］.林業(yè)科技通訊，1981(5):2－4.

［10］李秀文，姜樹新，王玉忠.白榆育苗技術(shù)要點［J］.河北林業(yè)科技，2010(1):87－88.

［11］圖 亞.蒙古黃榆組織培養(yǎng)及植株再生的研究［D］.呼河浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［12］張建鋒，龍莊如，梁玉堂.白榆新品種74009離體培養(yǎng)再生植株的研究［J］.山東林業(yè)科技，1991，81(04):18 －21.

［13］彭 冶，張金池.美國巖榆愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽形成［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，35(12):6 －7.

［14］唐曉杰，孟范例，程廣有.金葉榆組培快速繁殖技術(shù)研究［J］.北方園藝，2010(21):156 －158.

［15］宛淑艷，張常鐘，陸靜梅，等.大豆組織培養(yǎng)和原生質(zhì)培養(yǎng)研究的進展［J］.長春師范學(xué)院學(xué)報，2002，21(1):57 －60.

［16］王靜華，侯建生，劉桂林，等.兩種不同種源地白榆的組織培養(yǎng)與葉片再生研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25(5):110 －115.

［17］杜 盛，閆美杰.脫皮榆離體培養(yǎng)再生植株的研究［J］.內(nèi)蒙古林學(xué)院學(xué)報，1996，18(4):15 －17.

［18］楊捷威，吳婷婷，郭美麗.紅花組織培養(yǎng)的研究進展［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2010，12(1):58 －61.

［19］李天珍，李保堂，王笑然.糖和氮對白榆組織培養(yǎng)新梢生根的影響［J］.山西林業(yè)科技，2001(4):9 －11.

［20］梁一池，楊 華.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展［J］.福建林學(xué)院學(xué)報，2002，22(1):1 －3.

［21］陳學(xué)森，張艷敏，董 會.植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9(2):24 －27.

［22］蔡祖國，符樹根，黃寶祥，等.植物組織培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象的研究進展［J］.江西林業(yè)科技，2005(2):35－38.

［23］牛艷麗，張艷芳，杜 娟，等.植物細胞無性系變異的研究進展［J］.江西林業(yè)科技，2009(3):32 －34.