李愛玲，修瑞娟

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所，北京100005)

前列腺癌是老年男性最常見的惡性腫瘤之一，目前放化療的療效不佳。一氧化氮(NO)作為人體內(nèi)一種重要的生物調(diào)節(jié)性介質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)過一氧化氮合酶(NOS)作用生成。NO/內(nèi)皮型NOS(eNOS)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過促進腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞增殖、遷移，增強血管通透性，誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管新生等過程參與調(diào)節(jié)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展［1～3］?，F(xiàn)對NO/eNOS信號系統(tǒng)與前列腺癌的相關(guān)研究進展作一綜述。

1 NO/eNOS與前列腺癌

1.1 NO的生物學(xué)作用 前列腺組織內(nèi)存在非腎上腺素能、非膽堿能神經(jīng)，其中NO是其遞質(zhì)之一;NO也可作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌肽通過自分泌及旁分泌的方式影響前列腺的活動。NO作用主要與其局部濃度有關(guān)，持續(xù)低濃度的NO(pmol/L)具有促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和促血管新生作用，而高濃度NO(μmol/L)卻有抗腫瘤及顯著影響腫瘤免疫治療作用。NOS是NO生成的最主要的限速因子，NOS活性及其產(chǎn)生NO濃度、NOS細胞定位和基因多態(tài)性決定了NO生物學(xué)作用的復(fù)雜多樣性。

1.2 eNOS的組織細胞定位 NOS由1 025個氨基酸殘基組成，分子量為13.3 kD。NOS廣泛分布于機體內(nèi)各組織細胞。NOS主要有3種同工酶，誘導(dǎo)型(iNOS/NOS-2)、eNOS/NOS-3和神經(jīng)元型(nNOS/NOS-1)。eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細胞，巨噬細胞和組織間質(zhì)細胞亦有表達。eNOS是腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵酶，參與調(diào)控癌癥相關(guān)事件(血管新生、凋亡、細胞周期、侵襲和轉(zhuǎn)移)。通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，前列腺良性增生組織中血管內(nèi)皮細胞NOS染色呈強陽性，移行區(qū)和外周區(qū)的腺體上皮細胞亦可見深度不一的陽性染色。在荷瘤小鼠的前列腺組織可檢測到有兩種DDAH(一種代謝內(nèi)源NOS抑制劑的酶)，過表達DDAH可以增加組織NOS表達量并增強血管新生。其中DDAH-1的表達位點與nNOS有重疊，DDAH-2與eNOS有重疊。根據(jù)癌組織免疫組化分析，似乎 DDAH-2 占優(yōu)勢［4］。

1.3 eNOS基因多態(tài)性 eNOS基因多態(tài)性參與多種腫瘤的發(fā)生，而近期研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因多態(tài)性和前列腺癌發(fā)生危險之間有密切相關(guān)性，在前列腺癌發(fā)生發(fā)展和血管新生中eNOS的作用可能占據(jù)主導(dǎo)［5～7］。Ying 等［7］通過單核苷酸多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)NOS基因多態(tài)性(NOS3IVS7-26GG，NOS2IVS16+88GT/TT)是發(fā)生進展性前列腺癌的高危、易感因素。Safarinejad等［6］研究 eNOS基因多態(tài)(T-786C、G894T和4a/b)與前列腺癌發(fā)生危險和臨床特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與G894T無顯著相關(guān)，而是主要在于T-786C和4a/b。對于T-786C，CC基因型與前列腺癌發(fā)生危險性、分化程度、進展性正相關(guān);與4a/b bb型相比，4a/b ab和4a/b aa型發(fā)生癌變幾率大、惡性程度高。

2 NO/eNOS與前列腺癌細胞增殖

持續(xù)低濃度的NO可促進腫瘤細胞增殖，而高濃度NO卻有促細胞凋亡的作用［8］。NO是目前研究較為清楚的內(nèi)源性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)激活劑，其促進細胞增殖至少部分是通過激活sGC，生成GMP，促進細胞的DNA合成。在前列腺癌的研究中，離體培養(yǎng)前列腺癌細胞系LnCap，NOS抑制劑N-ω-硝基-L-精氨酸(L-NAME)處理 72 h，細胞增殖活性明顯下降，并具濃度依賴性［4］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細胞PC3MM2種植瘤，腺病毒介導(dǎo)的IL-β注射后，可通過上調(diào)iNOS、促進NO局部高濃度釋放瘤組織內(nèi)增殖性細胞少而凋亡性細胞增多，瘤內(nèi)微血管密度降低，使80%的種植瘤進展受抑，甚至20%的腫瘤消除［9］。

3 NO/eNOS與前列腺癌血管新生

3.1 NO/eNOS促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移 有很多證據(jù)已表明NO是血管新生調(diào)節(jié)劑［10］，促進腫瘤進展，和血管新生存在正相關(guān)性。其作用的分子機制主要涉及:激活sGC，募集cGMP和激活下游靶激酶和離子通道［8］。在3種同工酶中，eNOS在腫瘤的生長轉(zhuǎn)移和血管新生中可能占主導(dǎo)作用，因為是在eNOS－/－而不是 iNOS－/－的荷瘤鼠，腫瘤生長緩慢伴血管新生較弱。

3.2 NO促進細胞遷移、血管芽生 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以水解基底膜，促進細胞遷移，促進血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移。有報道，內(nèi)源產(chǎn)生的NO可干預(yù)牛的心肌毛細血管后靜脈內(nèi)皮細胞及小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中MMPs及其抑制劑TIMPs的合成與活性，平衡二者濃度［11，12］。NO 可以通過激活 sGCERK1/2途徑，上調(diào)鼠肺微血管內(nèi)皮細胞和前列腺癌細胞(LNCap)中多效蛋白(PTN，一種促血管新生和腫瘤生長因子)表達，從而促進細胞遷移、腫瘤進展。該作用在應(yīng)用L-NAME抑制NOS活性或者應(yīng)用sGC抑制劑完全抑制;前列腺癌細胞分泌的小窩蛋白不僅具有抗細胞凋亡作用，還具有促內(nèi)皮細胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)形成作用［13，14］。在用 L-NAME 抑制NOS活性或eNOS基因敲除鼠小鼠，該作用明顯下降。另外，VEGF可以上調(diào)內(nèi)皮細胞MMP-2基因表達、下調(diào) TIMP-1/2，該作用具 eNOS和 cGMP依賴性;可因與NOS抑制劑L-NAME或sGC抑制劑預(yù)先孵育而阻斷，而外源NO供體(硝普鈉)和NO的細胞內(nèi)介質(zhì)(8-Br-cGMP)可恢復(fù)此作用。而且有報道，氨基酸硝化作用可以調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞中MMP-13 及 TIMP-4 的表達［1，8，12］。

3.2 干預(yù)內(nèi)皮前體細胞的歸巢 梅開等［15］發(fā)現(xiàn)，Lewis荷瘤小鼠腹腔內(nèi)注射eNOS抑制劑L-NAME，隨著血清和腫瘤組織中NO濃度下降，血循環(huán)內(nèi)EPC數(shù)量下降。其機制與VEGF合成/釋放減少，或抑制VEGF與其受體的結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)皮祖細胞的動員和歸巢隨之減少有關(guān)。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白可以促進內(nèi)皮祖細胞誘導(dǎo)的血管新生包括內(nèi)皮分化、增殖、遷移和離體管狀結(jié)構(gòu)形成，其中機理就是通過NO激活介導(dǎo)。但梅開同時發(fā)現(xiàn)，若將轉(zhuǎn)染eNOS基因后的Lewis細胞接種至小鼠皮下成瘤，NO的異常增多亦可抑制內(nèi)皮祖細胞(EPC)的歸巢，腫瘤組織內(nèi)CD133+細胞數(shù)量和VEGF及其受體的表達卻顯著下降。但在前列腺癌尚未見報道。

3.3 NO介導(dǎo)血管新生因子的作用

3.3.1 NO與 VEGF 在乳腺癌存在 HIF1α-eNOSVEGF的促血管新生因子網(wǎng)絡(luò)，NO可誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生，而VEGF亦可通過上調(diào)eNOS而誘導(dǎo)NO生成［17］。主要機理可能涉及:①VEGF可激活PI3KAKT通路，上調(diào)NOS;②VEGF前體通過增強eNOS磷酸化而增強eNOS活性;③另外，VEGF能通過誘導(dǎo)鈣內(nèi)流和募集熱休克蛋白90激活eNOS［18］。在前列腺癌研究中，應(yīng)用 LnCap細胞接種裸鼠，DDAH-2、eNOS、iNOS和 VEGF表達均增高;而 NOS抑制劑L-NAME處理后可降低eNOS、iNOS和VEGF表達［6］。VEGF 可以誘導(dǎo) iNOS+/+或 iNOS－/－小鼠的血管新生，但對eNOS－/－鼠則無此效應(yīng)?？梢?，eNOS在VEGF介導(dǎo)的血管新生和血管通透性作用中占重要地位。由于VEGF是目前公認(rèn)的促血管新生作用因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。所以，選擇性調(diào)控 eNOS活性或協(xié)同抑制VEGF，可能將是前列腺癌治療中非常有用的治療策略。

3.3.2 NO與 HIF1α 腫瘤組織存在缺氧狀態(tài)，HIF1α與腫瘤進展、血管新生和治療抵抗關(guān)系密切。NOS啟動子上存在缺氧反應(yīng)元件(HRE)，可以在缺氧條件下促進NOS轉(zhuǎn)錄。NO可通過MAPK和PI3K途徑誘導(dǎo)HIF1α合成，并通過抑制羥化酶而消弱HIF1α的降解，繼而上調(diào)HIF1α下游靶基因，包括VEGF等促血管新生因子，從而形成 HIF1αeNOS-VEGF的促血管新生作用網(wǎng)絡(luò)，促進血管新生［19］。而最近研究發(fā)現(xiàn)，iNOS和(或)eNOS存在于所有HIF1-α陽性的口腔鱗狀上皮癌，提示NO具誘導(dǎo)HIF1α聚集及促腫瘤生長作用［20］。盡管未見有關(guān)前列腺癌的相關(guān)研究，但前列腺癌組織同樣存在缺氧狀態(tài)，是否存在HIF1α-eNOS-VEGF的促血管新生作用網(wǎng)絡(luò)有待進一步研究。

3.3.3 NO與其他血管新生因子 磷酸鞘氨醇、血管生成素、雌激素、剪切力、代謝應(yīng)激等均可以通過結(jié)合磷脂酶C/Ca2+-鈣調(diào)素及PI3K-AKT途徑激活eNOS;在較低水平下，內(nèi)源或外源NO可作為細胞內(nèi)第二信使誘導(dǎo)腫瘤細胞表達IL-8，一種間接的促血管新生因子。NO供體可通過上調(diào) FGF2，誘導(dǎo)VEGF表達和微血管內(nèi)皮增殖。應(yīng)用細胞培養(yǎng)模型，NO介導(dǎo)PGE2的內(nèi)皮生長刺激作用。

4 展望

NO作為人體內(nèi)一種重要的生物調(diào)節(jié)性介質(zhì)，不僅參與血管擴張、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和抗血小板聚集等多種心腦血管系統(tǒng)生理和病理過程，還參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。NO對腫瘤細胞的放射增敏作用目前研究較多，但其作為單藥或聯(lián)合用藥用于化療研究較少。因為，NO供體藥物的體內(nèi)給藥可能導(dǎo)致系統(tǒng)低血壓，增加腫瘤血液灌注和氧合作用，具有潛在的促腫瘤生長危險，而限制了它的應(yīng)用。如何利用NO的生物學(xué)特點，通過合適的載體靶向提高癌組織局部濃度，并建立相應(yīng)的實時監(jiān)測指標(biāo)對于指導(dǎo)治療將是有效的措施。

［1］Fukumura D，Kashiwagi S，Jain RK.The role of nitric oxide in tumour progression［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(7):521-534.

［2］Singh S，Gupta AK.Nitric oxide:role in tumour biology and iNOS/NO-based anticancer therapies［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2011，67(6):1211-1224.

［3］Lim KH，Ancrile BB，Kashatus DF，et al.Tumour maintenance is mediated by eNOS［J］.Nature，2008，452(7187):646-649.

［4］Vanella L，Di Giacomo C，Acquaviva R，et al.The DDAH/NOS pathway in human prostatic cancer cell lines:antiangiogenic effect of L-NAME［J］.Int J Oncol，2011，39(5):1303-1310.

［5］Lee KM，Kang D，Park SK，et al.Nitric oxide synthase gene polymorphisms and prostate cancer risk［J］.Carcinogenesis，2009，30(4):621-625.

［6］Safarinejad MR，Safarinejad S，Shafiei N，et al.Effects of the T-786C，G894T，and Intron 4 VNTR(4a/b)polymorphisms of the endothelial nitric oxide synthase gene on the risk of prostate cancer［J］.Urol Oncol，2012 Feb 6.［Epub ahead of print］

［7］Ying L，Hofseth LJ.An emerging role for endothelial nitric oxide synthase in chronic in ammation and cancer［J］.Cancer Res，2007，67(4):1407-1410.

［8］Aranda E，López-Pedrera C，De La Haba-Rodriguez JR，et al.Nitric oxide and cancer:the emerging role of S-nitrosylation［J］.Curr Mol Med，2012，12(1):50-67.

［9］Olson MV，Lee J，Zhang X，et al.Inducible nitric oxide synthase activity is essential for inhibition of prostatic tumor growth by interferon-beta gene therapy［J］.Cancer Gene Ther，2006，13(7):676-685.

［10］Singh JP.Dimethylarginine dimethylaminohydrolase:a new therapeutic target for the modulation of nitric oxide and angiogenesis［J］.Curr Opin Investig Drugs，2007，8(9):736-741.

［11］Donnini S，Monti M，Roncone R，et al.Peroxynitrite inactivates human-tissue inhibitor of metalloproteinase-4［J］.FEBS Lett，2008，582(7):1135-1140.

［12］Lizarbe TR，García-Rama C，Tarín C，et al.Nitric oxide elicits functional MMP-13 protein tyrosine nitration during wound repair［J］.FASEB J，2008，22(9):3207-3215.

［13］Polytarchou C，Hatziapostolou M，Poimenidi E.Nitric oxide stimulates migration of human endothelial and prostate cancer cells through up-regulation of pleiotroph in expression and its receptor protein tyrosinephosphatase beta/zeta［J］.Int JCancer，2009，124(8):1785-1793.

［14］Tahir SA，Yang G，Goltsov AA，et al.Tumor cell-secreted caveolin-1 has proangiogenic activities in prostate cancer［J］.Cancer Res，2008，68(3):731-739.

［15］梅開，蔡曉虹，杜磊，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶來源的NO調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成［J］.癌癥，2010，29(1):32-37.

［16］Wang Y，Yan W，Lu X，et al.Overexpression of osteopontin induces angiogenesis of endothelial progenitor cells via the avβ3/PI3K/AKT/eNOS/NO signaling pathway in glioma cells［J］.Eur J Cell Biol，2011，90(8):642-648.

［17］ Kafousi M，Vrekoussis T，Tsentelierou E，et al.Immunohistochemical study of the angiogenetic network of VEGF，HIF1α，VEGFR-2 and endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in human breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2012，18(1):33-41.

［18］Miao RQ，F(xiàn)ontana J，F(xiàn)ulton D，et al.Dominant-negative Hsp90 reduces VEGF-stimulated nitric oxide release and migration in endothelial cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(1):105-111.

［19］Ho JJ，Man HS，Marsden PA.Nitric oxide signaling in hypoxia［J］.JMol Med(Berl)，2012，90(3):217-231.

［20］Korde Choudhari S，Sridharan G，Gadbail A，et al.Nitric oxide and oral cancer:A review［J］.Oral Oncol，2012，48(6):475-483.