豬繁殖與呼吸綜合征研究進(jìn)展

韋敏，朱林，劉萍，薛敏

（重慶市武隆縣畜牧獸醫(yī)局，重慶武隆 408500）

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)導(dǎo)致的一種接觸性傳染病，主要引起豬厭食、體溫升高、妊娠母豬早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬、育肥豬發(fā)生呼吸障礙為特征的一種病毒病，并且能引起較高的死亡率。該病于1987年在美國的北卡羅來納州首先發(fā)現(xiàn)，然后迅速向世界各地蔓延, 目前為止,世界上僅有少數(shù)幾個(gè)國家沒有該病的發(fā)生與流行，如瑞典、新西蘭、澳大利亞等。在此病的發(fā)生到傳播期間，由于病原不清曾有過許多病名，1991年Wensvoort 等首次分離到該病毒，并命名為 (lelystad virus , LV)，直到1992年，歐共體才將其統(tǒng)一命名為“豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)”。1992年5月，國際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已將其列為B級疾病。1996 年郭寶清等首次從國內(nèi)PRRS血清陽性豬群中分離到PRRSV，從而證實(shí)了我國也有此病的流行，近年來該病在我國也呈現(xiàn)了蔓延和流行的態(tài)勢。目前，PRRS已蔓延至世界所有養(yǎng)豬國家和地區(qū)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。因此，人們對其進(jìn)行了大量科學(xué)研究，本文就PRRSV分子生物學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)以及流行病學(xué)方面對其進(jìn)行進(jìn)一步闡述，為其防治和疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

一、病原學(xué)及分子生物學(xué)方面研究和診斷

從1991年該病毒分離以來，人們對PRRSV進(jìn)行了多方面的研究，現(xiàn)已明確，PRRSV 屬于尼多目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，與鼠乳酸脫氫酶病毒(LDV) 馬動(dòng)脈炎病毒(EAV) 和猴出血熱病毒(SHFV) 為同一屬。由于PRRSV的基因序列存在較大的差異，PRRSV可分為兩大類型，即歐洲型(代表毒株:Lelystade株)與美洲型(代表毒株:ATTCVR-2332)，我國分離到得毒株為美洲型，尚未見歐洲型報(bào)道。

對PRRSV的分子生物學(xué)診斷方法主要有核酸探針雜交技術(shù)以及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)。對于疑似病例可以采取RT-PCR，對提取的病料RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，可擴(kuò)增出所需的目的片段，經(jīng)連接測序分析，提取的為PRRSV的野毒株。RT-PCR檢測法具有快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏且可早期診斷等特點(diǎn)，為病毒檢測的常用方法之一。

目前，預(yù)防PRRS的方法主要是采用弱毒苗和滅活苗，但是這兩種疫苗的安全性都不是很高，存在毒力返強(qiáng)和傳播疫苗毒的危險(xiǎn)，因此尋找安全、效果可靠、有效的基因工程疫苗迫在眉睫。對于PRRS的ORF1-ORF7的研究及PRRSV感染性克隆的成功構(gòu)建，通過基因的缺失或替換基因組的某些部分等基因工程技術(shù)而研制出安全、高效的基因工程疫苗已以成為可能。另外，PRRSV DNA疫苗研究也取得了較好的效果，將GP5基因克隆到巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子的控制之下構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒，制備DNA疫苗，免疫仔豬后可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，實(shí)驗(yàn)室攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有良好的保護(hù)效果。因此，DNA 疫苗有望成為今后PRRSV疫苗的重點(diǎn)研究方向。

二、血清學(xué)方面研究及診斷

最初診斷PRRS最確切的方法是病毒分離。病毒分離時(shí)采用的病料最好采用死胎或弱仔豬的心、肝、肺、腦、脾、腎等組織勻漿的混合物。對哺乳仔豬和斷奶仔豬最好取肺臟，母豬可取血漿、血清和白細(xì)胞，公豬可采取血清和精液，木乃伊胎兒難以分離到病毒。分離PRRSV適用的細(xì)胞有豬肺泡巨噬細(xì)胞和MARC-145、CL2621、CRL11171等細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)分離的PRRSV可制成超薄切片，進(jìn)行電鏡觀察，觀察病毒的形態(tài)，以便確診。

除了常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)，電鏡觀察之外，對PRRS的檢測診斷主要采取血清學(xué)診斷方法，通常采取的方法有免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、血清中和試驗(yàn)(SN)及其他一些血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。

IPMA法：這是荷蘭中央獸醫(yī)研究所的Wensvoort于1991年率先建立的一種檢測PRRSV抗體的方法，實(shí)驗(yàn)主要在PAM、CL2621、MA104、MARC-145 細(xì)胞上進(jìn)行。該法敏感性、特異性都較好，可用于PRRSV 的抗原檢測、病毒鑒定及血清抗體檢測等，能在感染后6 d的血清中檢測到抗體。但是本實(shí)驗(yàn)也有其缺點(diǎn)，即由于實(shí)驗(yàn)判定的主觀性較強(qiáng),不利于自動(dòng)化操作，不適于大規(guī)模普查。

ELISA法：此法主要用于檢測PRRSV抗體，Albina等用PRRSV接種PAM培養(yǎng)，制備陽性抗原，并用相同的方法制備模擬抗原，首次建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA。通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，ELISA檢測方法的敏感性和特異性較好，且抗原用量少，節(jié)省材料，不需要特殊儀器，快速、經(jīng)濟(jì)及敏感，結(jié)果便于長期保存等優(yōu)點(diǎn)，明顯優(yōu)于其他檢測方法。鑒于此，已有許多國家將本法列為常規(guī)診斷方法，且有相應(yīng)的試劑盒可供使用。

SN法：該法主要用于檢測PRRSV抗體，用MARC-145細(xì)胞在96孔微量板上進(jìn)行。由于傳統(tǒng)的中和實(shí)驗(yàn)不能檢測出急性感染期抗體，還需要加入雙份的血清。Yoon和Takikawa等在血清和病毒混合液中加入補(bǔ)體, 提高了反應(yīng)的敏感性, 可在PRRSV 感染早期作出診斷。

還有其他一些血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，如用于檢測感染組織中PRRSV 抗原的免疫膠體金技術(shù)、親和素-生物素免疫過氧化物酶試驗(yàn)、間接熒光抗體技術(shù)(IFA)等。

三、免疫學(xué)方面研究及診斷技術(shù)

PRRSV的免疫學(xué)特性和免疫抑制機(jī)理的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。PRRSV可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全身性體液免疫應(yīng)答，在感染第七天，可采用ELISA法檢測出PRRSV的特異性抗體IgG和IgM，采用Western blot可檢出抗核衣殼N蛋白特異性抗體；感染第9～35天可檢出抗內(nèi)膜蛋白M和抗E蛋白抗體。有研究證據(jù)表明，E蛋白和M蛋白在病毒中和作用中極為重要。

PRRS是一種病毒病，目前尚無特效的治療藥物，控制該病的發(fā)生和傳播的主要措施仍然是疫苗的免疫接種。在地方流行性區(qū)域給動(dòng)物接種疫苗，對于預(yù)防繁殖障礙比較有效；Rogan等研究表明，用PRRS滅活苗免疫豬后，可減少豬病毒血癥的發(fā)生，有效阻止豬肺部病變。但是，通過接種疫苗來控制PRRS仍然存在較多的問題。滅活苗和弱毒苗雖然都能減輕臨床癥狀，但是不能阻止病毒的再次感染和病豬的排毒，而且滅活疫苗雖然安全，但是其產(chǎn)生的保護(hù)力較弱，需要多次免疫接種；和滅活疫苗相比，弱毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)更長、也更有效，但是其本身存在散毒問題，而且有返強(qiáng)的危險(xiǎn)，還可能造成疫苗毒的傳播，引起PRRS的持續(xù)感染和病毒血癥的發(fā)生；而且，血清學(xué)的方法不能檢測免疫豬和自然感染豬。據(jù)報(bào)道，1996年丹麥?zhǔn)褂妹绹娜醵疽呙绾笠鹆薖RRS的大暴發(fā)。因此，許多國家現(xiàn)在已經(jīng)禁止使用弱毒疫苗或限制使用疫苗來控制臨床暴發(fā)。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的興起，特別是DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)，為研制新一代的疫苗提供了嶄新的方法。目前利用基因工程技術(shù)已經(jīng)和正在研制開發(fā)的新型疫苗主要有亞單位疫苗、活載體疫苗、DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗、合成肽疫苗、抗獨(dú)特型疫苗等。對PRRSV基因工程疫苗的研究主要集中在亞單位疫苗、活載體疫苗和DNA疫苗。

（一）亞單位疫苗PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白免疫原性的研究已比較清楚。PRRSV感染豬體后，血清中抗PRRSV的免疫球蛋白主要是針對N蛋白和M蛋白，GP3雖不能刺激中和抗體的產(chǎn)生，但可對仔豬提供保護(hù)，GP4、GP5和M蛋白可產(chǎn)生中和抗體，GP5比GP4產(chǎn)生中和抗體的能力更強(qiáng)。亞單位疫苗及其它新型疫苗的研究多針對這些蛋白。

（二）活載體疫苗PRRS的活載體疫苗主要有以偽狂犬病毒和腺病毒為載體來表達(dá)PRRSV的抗原基因。因?yàn)樗苊饬薖RRS滅活疫苗和弱毒疫苗的缺陷，可同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，而且還可構(gòu)建多價(jià)疫苗，因此成為PRRS疫苗的研究熱點(diǎn)。

（三）DNA疫苗PRRSV DNA疫苗研究也取得了較好的效果,將GP5基因克隆到巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子的控制之下構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒,制備DNA疫苗,免疫仔豬后可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體,實(shí)驗(yàn)室攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有良好的保護(hù)效果。由于DNA 疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫,并且對不同的血清型的毒株具有交叉保護(hù)性,有可能克服病毒外殼蛋白變異導(dǎo)致的免疫逃脫現(xiàn)象。因此,DNA疫苗有望成為今后PRRSV 疫苗的重點(diǎn)研究方向。

總之, 目前對于PRRSV病毒已進(jìn)行了大量的研究，人們對其從分子生物學(xué)、血清學(xué)及免疫學(xué)方面進(jìn)行了深入的研究，并取得了很大的進(jìn)展，PRRSV的分類地位已基本確立, 分子結(jié)構(gòu)已逐步明確,單克隆抗體的建立以及各種診斷方法相繼問世,疫苗試制成功,使人們對PRRS的認(rèn)識不斷加深,神秘豬病已不再神秘,控制本病也不再是束手無策。但在呼吸及生殖系統(tǒng)病變的病理學(xué)機(jī)制、病毒與宿主的相互作用、病毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、病毒的持續(xù)感染、分子免疫機(jī)制及通用疫苗的研制、PRRSV感染后易感染其他疾病的原因和建立快速、準(zhǔn)確、方便的臨床診斷方法等方面都還有待進(jìn)一步深入研究。早日闡明這些機(jī)理將對PRRS的預(yù)防和控制具有重要的指導(dǎo)意義。