復(fù)方莪術(shù)散對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者異位、在位內(nèi)膜組織中p21表達(dá)的影響

劉 筠，曹保利，魏 明

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070;2天津市南開(kāi)醫(yī)院)

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡女性的常見(jiàn)病之一，其細(xì)胞的增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等特性及復(fù)發(fā)率高的臨床特點(diǎn)均提示其具有惡性腫瘤的生物學(xué)行為，已有研究證實(shí)了二者的相似性［1］。研究證實(shí)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在惡性腫瘤的藥物治療中發(fā)揮重要作用，其中p21蛋白是細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶(CDK)抑制因子之一，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［2］。2011年1月～2013年1月，我們觀察了復(fù)方莪術(shù)散對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫(簡(jiǎn)稱(chēng)巧克力囊腫)患者異位和在位內(nèi)膜組織中p21蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇天津市南開(kāi)醫(yī)院婦科因巧克力囊腫行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的患者69例，其中35例(用藥組)于手術(shù)前3個(gè)月開(kāi)始規(guī)律服用復(fù)方莪術(shù)散直至手術(shù)當(dāng)日停藥，34例(手術(shù)組)術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何治療直接手術(shù);用藥組年齡(32．0±6．1)歲，根據(jù)美國(guó)生育協(xié)會(huì)修訂的子宮內(nèi)膜異位癥分期法(r-AFS，1985)分為Ⅱ期8例、Ⅲ期17例、Ⅳ期10例;手術(shù)組年齡(33．1±7．2)歲，r-AFS分期Ⅱ期 5例、Ⅲ期18例、Ⅳ期11例;選擇同期因子宮肌瘤行手術(shù)者30例作為對(duì)照組，年齡(32．5±6．7)歲。排除伴有子宮內(nèi)膜病變、無(wú)規(guī)律月經(jīng)周期、術(shù)前3個(gè)月接觸激素類(lèi)藥物、放置過(guò)宮內(nèi)節(jié)育器、妊娠、哺乳及合并有子宮腺肌病、功血及多囊卵巢綜合征等其他激素依賴(lài)性疾病者。各組年齡、藥物組和手術(shù)組r-AFS分期均無(wú)顯著差異(P均＞0．05)。

1．2 方法

1．2．1 治療方法 用藥組術(shù)前3個(gè)月服用中藥復(fù)方莪術(shù)散，方藥:三棱、莪術(shù)、淫羊藿、延胡索及黃芪各10 g，各單藥由江陰天江藥業(yè)有限公司制成顆粒劑型，5味中藥一次性沖服，2次/d，經(jīng)期不停藥，連服3個(gè)月;手術(shù)組及對(duì)照組均未用藥。用藥組和手術(shù)組在月經(jīng)結(jié)束后3～7 d行卵巢巧克力囊腫剝除術(shù)，術(shù)中取子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁組織，切除子宮者切取子宮內(nèi)膜組織，保留子宮者刮取子宮內(nèi)膜組織;對(duì)照組在月經(jīng)結(jié)束后3～7 d行子宮肌瘤切除術(shù)，術(shù)前常規(guī)于子宮內(nèi)膜增殖期行診斷性刮宮(以除外子宮內(nèi)膜疾病)，刮取正常子宮內(nèi)膜組織。

1．2．2 檢測(cè)方法 采用免疫組化法。常規(guī)4%甲醛固定組織，石蠟包埋，組織切片厚4μm，HE染色后挑選具有典型內(nèi)膜及間質(zhì)的組織標(biāo)本為入選標(biāo)本。撈片后置烤箱60 min，切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)3%H2O2滅活內(nèi)源性酶10 min、檸檬酸鈉高壓修復(fù)2．5 min后，5%BSA 室溫封閉 20 min。一抗(1∶150)4℃過(guò)夜，37℃烤箱復(fù)溫30 min;加入二抗于37℃烤箱20 min，37℃烤箱 SABC染色20 min，DAB顯色3～4 min，蘇木素復(fù)染，脫水封片;嚴(yán)格按照SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每張切片于100倍光鏡下選取5個(gè)代表性視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞;p21陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核上，陽(yáng)性表達(dá)呈棕色，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞或陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性(－);陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)5% ～25%為弱陽(yáng)性(+);陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)25% ～50%為陽(yáng)性(++);陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++);+～+++為陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖1。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較采用 χ2檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組子宮內(nèi)膜p21蛋白表達(dá)比較 p21在對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為56．7%，在手術(shù)組異位、在位內(nèi)膜組織中分別為17．7%、26．5%，在用藥組異位、在位內(nèi)膜組織中分別為40．0%、48．6%。對(duì)照組和用藥組異位、在位內(nèi)膜p21表達(dá)率均高于手術(shù)組異位、在位內(nèi)膜，P均＜0．05;對(duì)照組和用藥組異位、在位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率比較，P均＞0．05。

2．2 p21蛋白表達(dá)與臨床分期的關(guān)系 異位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率在用藥組Ⅱ期患者中為50%(4/8)、Ⅲ ～ Ⅳ期為37．0%(10/27)，在手術(shù)組分別為40．0%(2/5)、13．7%(4/29);用藥組Ⅱ期患者異位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率高于手術(shù)組，P＜0．05;Ⅲ～Ⅳ期比較，P＞0．05。在位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率用藥組Ⅱ期患者中為75．0%(6/8)、Ⅲ ～Ⅳ期為32．4%(12/27)，手術(shù)組分別為60．0%(3/5)、24．1%(7/29);用藥組Ⅱ期患者在位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率高于手術(shù)組，P ＜0．05;Ⅲ ～ Ⅳ期比較，P ＞0．05。兩組Ⅲ～Ⅳ期異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率和Ⅱ期比較，P 均 ＞0．05。

3 討論

p21蛋白是目前已知的、具有最廣泛CDK抑制活性的細(xì)胞周期蛋白，幾乎可以和每一個(gè)Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，發(fā)揮抑制作用。有研究證實(shí)，p21高表達(dá)可使細(xì)胞周期阻滯于G1期、G2期或S期［3］，在某些條件下，p21具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［4～6］。癌組織中p21表達(dá)與腫瘤Dukes分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，其中C期和D期患者的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于A期和B期患者，有淋巴轉(zhuǎn)移者低于無(wú)轉(zhuǎn)移者，提示p21的表達(dá)與結(jié)腸癌的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)與食管癌、胃癌的組織學(xué)類(lèi)型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示p21蛋白表達(dá)減少可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖，腫瘤生長(zhǎng)迅速［7，8］。韋瑞紅等［9］研究表明，p21 蛋白的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。在子宮內(nèi)膜腺癌患者中，p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高，細(xì)胞增殖能力較低，提示腫瘤細(xì)胞的增殖可能與p21蛋白缺失有關(guān)，p21蛋白缺失通過(guò)直接或間接途徑增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖活性。

有研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)異常有關(guān)［10，11］，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究顯示，p21蛋白在對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于用藥組和手術(shù)組，p21低表達(dá)減少了其與Cyclin-CDK復(fù)合物的結(jié)合，從而減弱了其對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，進(jìn)而加速細(xì)胞周期的增殖進(jìn)程。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，子宮內(nèi)膜異位癥的基本病機(jī)為瘀血阻滯胞宮、沖任［12］。手術(shù)是本病的首選治療方法，但如何降低手術(shù)后的高復(fù)發(fā)率是治療成敗的關(guān)鍵。曹保利教授以活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、益腎扶正、行氣止痛為治則，研制出中藥復(fù)方莪術(shù)散，由三棱、莪術(shù)、淫羊藿、延胡索及黃芪5味中藥顆粒劑組成。王琰等［13］研究表明，莪術(shù)中含有姜黃素和吉馬酮，姜黃素對(duì)人卵巢癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌的相關(guān)細(xì)胞有一定的抑制作用，具有較強(qiáng)的抗癌、抗炎作用;吉馬酮也有一定的抗癌活性。徐立春等［14］研究也表明，三棱、莪術(shù)提取物修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗可以明顯增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)。有臨床研究證實(shí)，復(fù)方莪術(shù)散防治子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后復(fù)發(fā)療效與孕三烯酮、達(dá)菲林相近似，且不良反應(yīng)較西藥明顯減少［15，16］。

本研究結(jié)果顯示，用藥組異位和在位內(nèi)膜中p21蛋白表達(dá)明顯提高，提示復(fù)方莪術(shù)散可以提高子宮內(nèi)膜異位癥患者p21的表達(dá)，進(jìn)而減慢細(xì)胞增殖的進(jìn)程。從臨床分期來(lái)看，復(fù)方莪術(shù)散對(duì)Ⅱ期患者p21蛋白表達(dá)有明顯升高作用，提示其對(duì)中度內(nèi)異癥患者的療效優(yōu)于重度患者?？滦幍龋?7］研究表明，某些細(xì)胞周期蛋白在卵巢異位子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)隨臨床分期的增加呈遞增趨勢(shì)。本研究中，用藥組和手術(shù)組異位和在位內(nèi)膜p21陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅲ～Ⅳ期患者和Ⅱ期比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;我們推測(cè)可能與樣本量過(guò)小有關(guān)，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

［1］Varma R，Rollason T，Gupta JK，et al．Endometriosis and the neoplastic process［J］．Reproduction，2004，127(3):293-304．

［2］Wang Z，Nie Z，Chen W，et al．RNF115/BCA2 E3 ubiquitin ligase promotes breast cancer cell proliferation through targeting p21(Waf1/Cip1)for ubiquitin-mediated degradation［J］．Neoplasia，2013，15(9):1028-1035．

［3］Radhakrishnan SK，F(xiàn)eliciano CS，Najmabadi F，et al．Constitutive expression of E2F-1 leads to p21-dependent cell cycle arrest in S phase of the cell cycle［J］．Oncogene，2004，23(23):4173-4176．

［4］Rodriguez R，Meuth M．Chk1 and p21 cooperate to prevent apoptosis during DNA replication fork stress［J］．Mol Biol Cell，2006，17(1):402-412．

［5］Lee E，Choi MK，Han IO，et al．Role of p21CIP1 as a determinant of SC-560 response in human HCT116 colon carcinoma cells［J］．Exp Mol Med，2006，38(3):325-331．

［6］Li CH，Tzeng SL，Cheng YW，et al．Chloramp henicol-induced mitochondrial stress increases p21 expression and prevents cell apoptosis through a p21-dependent pathway［J］．JBiol Chem，2005，280(28):26193-26199．

［7］張正坤，苗龍，田君才，等．結(jié)直腸癌中 CDX2、p21H-ras、p21WAF1表達(dá)的臨床意義［J］．胃腸病學(xué)，2010，15(2):102-105．

［8］王言飛，劉玉芝，李蓮娜，等．p21蛋白在食管鱗癌中表達(dá)的臨床意義［J］．實(shí)用診斷與治療雜志，2008，22(2):108-110．

［9］韋瑞紅，黃海玉，彭碧玲．PCNA和p21蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義［J］．中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012，26(6):568-570．

［10］Nasu K，NishidaM，Ueda T，et al．Bufalin induces apoptosis and the G0/G1cell cycle arrest of endometriotic stromal cells:a promising agent for the treatment of endometriosis［J］．Mol Hum Reprod，2005，11(11):817-823．

［11］Cho NH，Choi YP，Moon DS，et al．Induction of cell apoptosis in non-small cell lung cancer cells by cyclin A1 small interfering RNA［J］．Cancer Sci，2006，97(10):1082-1092．

［12］張玉珍．中醫(yī)婦科學(xué)［M］．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2005:130-136．

［13］王琰，王慕鄒．莪術(shù)的質(zhì)量研究［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(11):849-853．

［14］徐立春，孫振華，陳志琳，等．三棱，莪術(shù)提取物的腫瘤細(xì)胞疫苗的非特異性抗瘤實(shí)驗(yàn)［J］．癌癥，2001，20(12):1380-1382．

［15］李欣，曹保利，李繼坤，等．中藥輔助治療中重度子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后療效觀察［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2011，18(2):97-99．

［16］倪俏，曹保利．李繼坤，等．復(fù)方莪術(shù)散在子宮內(nèi)膜異位癥腹腔鏡術(shù)后的臨床應(yīng)用［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(6):663-664．

［17］柯小寧，康山，李琰，等．細(xì)胞周期蛋白D1與蛋白質(zhì)P16在異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及臨床意義［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40(4):278-280．