蛋白C的檢測方法及研究進展

陸松松，吳迪綜述，賈玫審校

(北京大學人民醫(yī)院檢驗科，北京 100044)

蛋白C是體內重要的抗凝血因子，其在體內的水平與年齡相關，多種因素可導致蛋白C缺乏。蛋白C缺乏癥人群發(fā)病率為0.2%~0.5%，在血栓病患者中的發(fā)病率為5%~15%。大部分蛋白C缺乏癥無明顯的臨床癥狀，2%的蛋白C缺乏癥有明顯而嚴重的臨床癥狀[1]。 嚴重的蛋白C缺乏癥會使凝血與抗凝及纖溶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，從而引發(fā)血栓性疾病，如深靜脈血栓形成、彌散性血管內凝血等，也有報道稱蛋白C缺乏與早期流產(chǎn)相關。目前蛋白C的檢測主要有三種，一是檢測蛋白C的含量；二是檢測蛋白C的功能；三是通過檢測蛋白C基因PROC突變來診斷蛋白C缺乏。本文主要對蛋白C的檢測方法及應用的研究進展進行綜述。

1 蛋白C的性質及功能

蛋白C是維生素K依賴的血漿蛋白，它主要由肝臟合成，半壽期與凝血因子FⅦ相近，約為6h，比其它的維生素K依賴的凝血因子如FⅡ、FⅨ、FX要短。絲氨酸蛋白酶激活蛋白C，使之成為活化的蛋白C(APC)，APC與血管內皮上的內皮細胞蛋白C受體結合[2]?；罨鞍證具有下列功能：(1)滅活凝血因子FVa和FⅧa，降解凝血活酶的形成速度，產(chǎn)生抗凝作用；APC對因子Ⅴa和Ⅷa的滅活作用是迅速的，3μg/ml的APC在3min內，可使80%因子FVa、FⅧa滅活[3]；(2)APC能刺激內皮細胞釋放tPA等纖溶酶原激活物，亦能滅活組織纖溶酶原活化抑制物(PAl)，參與促纖溶作用；(3)具?；饣钚裕瑢Χ喾N人工合成底物如S-2238、S-2366等起酰基水解作用。人體內血漿蛋白C含量有隨年齡增長而增加的現(xiàn)象，每10年約增加4%[4]。

2 蛋白C基因(P R O C)

蛋白C基因位于染色體2q13-14，其基因序列共有10802個堿基，含有9個外顯子(共1790bp)和8個內含子，而編碼蛋白C的外顯子有8個。該基因的多種突變與蛋白C缺乏癥相關，目前，報道其超過300種變異體，且目前沒有發(fā)現(xiàn)明顯的種族及地區(qū)的差異。遺傳型的蛋白C缺乏癥為常染色體的顯性遺傳，75%為單堿基的錯義突變或者無義突變，少數(shù)為片段缺失或者插入突變。蛋白C缺乏有兩種表現(xiàn)：一種是蛋白C含量降低，活性降低；而另一種為蛋白C含量正常，而活性降低[5]。后者的變異體多為錯義突變(http://www.itb.cnr.it/procmd/)。

3 通過血漿檢測蛋白C缺乏的方法

臨床上蛋白C常用枸櫞酸鈉抗凝血進行檢測，國際上首次制定蛋白C檢測的標準品是在1988年，利用凍干的蛋白C作為標準品來校準各實驗室的儀器[6]。2006年，國際生物制品標準品及質控品委員會(NIBSC)再次對蛋白C的標準品進行了校準，目前，蛋白C檢測具有可溯源的校準品。早期對蛋白C功能的檢測主要是通過與凝血酶或者血栓調節(jié)蛋白與凝血酶的復合物反應，然后通過凝固法或者顯色底物法來檢測活化的蛋白C(APC)。但是此方法復雜且費用昂貴，隨后很多實驗室用免疫電泳法來檢測，但是這種檢測蛋白C抗原的方法不能分析其功能，不適用于蛋白C含量正常而功能下降的Ⅱ型蛋白C缺乏癥的診斷。

現(xiàn)在，蛋白C活性的檢測大多通過商品試劑ProtacR。ProtacR是單鏈的蛋白酶，由銅斑蛇毒純化提取的產(chǎn)物。ProtacR能夠極其快速地激活蛋白C使之成為APC，可以有效地排除蛋白C抑制劑對試驗的影響。凝固法的試驗是基于APC滅活FVa、FⅧa，從而引起血液凝固時間的變化，通過標準曲線定量蛋白C。顯色底物法是基于顯色底物氨基酸的分解，而測定比色程度來實現(xiàn)的。目前對于檢測蛋白C缺乏的篩查比較推薦的方法是顯色法，因為顯色法干擾因素較少，且比凝固法準確[7]。

3.1 凝固法檢測蛋白C 測定目標為蛋白C的抗凝活性，即對凝血因子FVa、FⅧa的滅活能力。本實驗是一種基于活化部分凝血活酶時間(APTT)，首先將待檢測的血漿蛋白C稀釋，然后與缺乏蛋白C的血漿混合，加入APTT試劑，最后加入ProtacR。ProtacR將蛋白C激活為APC，APC滅活FVa、FⅧa，最終使APTT延長，檢測結果可從抗凝時間標準曲線中讀出，以百分數(shù)表示。如FⅧ含量過量以及FV Leiden突變，可導致檢測結果的假性偏低；如果被檢測血漿中含有狼瘡抗凝物質，則檢測結果假性偏高。這些影響因素可通過顯色底物法來排除，或者結合抗原含量的檢測來綜合評估。對于FV Leidenn突變的樣品，可行的方法是將樣本與乏蛋白C血漿按照1:4混合，然后測定混合物蛋白C的活性，但當?shù)鞍證含量極低的時候，會降低混合血漿檢測方法的靈敏度。目前認為肝素含量低于1~2U/ml，不會影響凝固法的檢測，但是當含有阿加曲班、水蛭素、比伐盧定等凝血酶抑制劑時，會使檢測結果假性升高[8]。因此給予APTT的凝固法檢測蛋白C活性的特異性不高一直是此方法的弊端。

凝固法的第二種類型是基于Russell蛇毒凝固時間(RVV-X)，此方法不受高濃度的FⅧ的影響(<1000U/ml)，且受到狼瘡抗凝物質的影響也較小[9]。

凝固法檢測蛋白C的活性是最接近蛋白C真實的生物功能的一種方法，因此長久以來一直在應用，但是此方法的特異性較差，干擾因素較多，因此，在臨床檢測時要結合其他的檢測方法來最終確定蛋白C是否缺乏。

3.2 顯色底物法檢測蛋白C底物顯色法通過測定產(chǎn)色底物的吸光度變化來推測所測物質的含量和活性的。顯色底物為小分子的寡肽，其通過肽鍵與對硝基苯胺鏈接成為復合物。在待檢血漿中加入ProtacR，使蛋白C激活為APC，APC作用于上述復合物中，斷開肽鍵使對硝基苯胺脫落，從而使溶液呈黃色，在波長為405nm下的吸光度做標準曲線[10]。此方法中針對APC的顯色底物缺乏特異性，也可被其他的酶水解為對氨基苯胺，從而顯色，常見的干擾酶類有凝血酶、活化的FⅩa、激肽釋放酶和組織纖維酶原激活劑等。這些酶類的干擾作用與實驗室對樣本分析條件有關。目前認為APC與底物作用的時間在5~10min就會產(chǎn)生非特異性裂解的氨基酸。而在相同的反應試劑下，30s的作用時間則會產(chǎn)生極少的非特異性產(chǎn)物。在通常的試驗中，需要在校準品、質控品、檢測樣本中加入ProtacR，同時在另一份校準品、質控品、檢測樣本中加入水作為空白對照，以空白對照產(chǎn)生的吸光度OD值作為本底OD，但是有學者認為，當反應只有30s時，本底OD是極低的，Khor等對898例樣本進行在30s反應時間下有無空白對照的對比試驗，發(fā)現(xiàn)有886例結果偏差小于3IU/dl，7例偏差在3~5IU/dl之間，4例在4~5IU/dl之間，只有一例偏差為15IU/dl，因此Khor推薦的反應模式為：30s反應時間，只有樣本來自DIC患者、含有組織纖溶酶原激活劑的樣本或者采血緩慢的幼兒時才應用空白對照。這樣可排除干擾物質的作用，縮短報告時間，同時節(jié)省試劑成本[8]。另外當肝素含量不超過2U/ml時不會影響檢測結果，而且凝血酶抑制劑亦不會影響試驗。

3.3 蛋白C抗原含量檢測法 蛋白C抗原檢測是指檢測血漿中蛋白C的含量，而與其是否有活性無關。通常用到的方法有放射免疫擴散法、免疫電泳法以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。雖然蛋白C抗原檢測對于Ⅱ型蛋白C缺乏癥不敏感，但是，當需要鑒別蛋白C缺乏的類型時，蛋白C抗原的檢測有重要的作用，當一樣本蛋白C含量正常，但是活性卻很低的時候可以考慮其為Ⅱ型。對于用華法林的蛋白C缺乏癥患者，蛋白C抗原的含量結合FⅦ、FX的水平來診斷其是否為Ⅰ型蛋白C缺乏癥。值得注意的是，此時要使患者的INR在2~4之間，這樣檢測出來的FⅦ、FX才能與蛋白C進行PC/(FⅡ抗原+FX抗原)/2計算，以比值的方式與正常人做比較。對于存在維生素K抵抗的患者，不能應用蛋白C抗原的含量與依賴于維生素K的凝血因子進行比值計算分析[11]。

免疫電泳法檢測蛋白C抗原，需要有特殊的儀器，實驗時間較長，且電泳時需要對身體有害的鈣螯合劑，因此目前應用較少。

早期ELISA方法受到類風濕因子的影響，產(chǎn)生假性的蛋白C升高。De Jager發(fā)現(xiàn)應用適當?shù)淖钄鄤┛梢员苊忸愶L濕因子的干擾。Cooper等應用聚乙二醇沉淀法去除了非特異性的結合，避免了假性升高。同時發(fā)現(xiàn)，此方法對Ⅱ型蛋白C缺乏癥的檢測有重要的意義[12]。ELISA方法靈敏度高，可以檢測到低于5U/dl的水平，檢測結果無需推算，可以直接在標準曲線讀出。

4 基因水平上的蛋白C檢測

遺傳性蛋白C缺乏癥一般認為是常染色體顯性遺傳，但部分純合蛋白C缺陷癥患者表現(xiàn)為隱性遺傳?；驒z測蛋白C對于遺傳性家族性蛋白C缺乏癥有重要的診斷價值，同時對于產(chǎn)前診斷有重要的意義。另外基因檢測可以對攜帶突變基因的人群進行分析。大多數(shù)PROC突變?yōu)殡s合子型，其蛋白C活性與正常人群相近，或略低于正常人，無明顯的臨床癥狀[13]?；驒z測若發(fā)現(xiàn)已經(jīng)明確的變異體類型，則可排除獲得性蛋白C缺乏癥，對臨床診療有重要的作用。目前認為基因檢測蛋白C對于血栓形成風險的評估沒有絕對性的意義，但是對于家族性蛋白C缺乏癥有重要的診斷價值。

目前已經(jīng)報道的突變有300多種，高加索人群最常見的為Arg230Cys,Arg178Trp,Gln132X,Val297Met and Pro168Leu，日本報道的主要突變有Phe139Val,Arg169Trp,Val297Met,Met364Ile,以及G8857del。Q.Ding等對23例中國漢族人群蛋白C缺乏癥進行了基因分析，報道的突變位點為：Glu71 Lys ，Asp170Tyr，Cys175Tyr，Thr337 Ile,Leu386Pro，Trp414X。中國漢族人群蛋白C變異體的類型由于報道例數(shù)較少，因此尚不完善，有待于進一步研究，完成基因背景分析對以后的臨床應用有一定的指導作用。

因為大多數(shù)的突變?yōu)辄c突變，因此首先要找到致病突變點，對PROC進行全外顯子、剪接位點及啟動子進行測序。如未發(fā)現(xiàn)致病突變，則需要Southern雜家的方法進一步檢測是否有缺失突變，插入突變或者基因重排。一旦找到致病突變，則家系分析就變得容易了，也可以很快的找到攜帶者，并可估算其臨床表現(xiàn)。

人類基因組突變委員會 (HGVS)推薦了檢測DNA、RNA的標準方法，可在http://www.hgvs.org/mutnomen/,nomenclature for the description of sequence variants.中查到相關信息。另外關于PROC的參考序列NG_016323.1(genomic),NM_000312.3(mRNA)，NP_000303.1(protein) 可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/中查到。

5 小結

蛋白C缺乏的篩選試驗建議用顯色底物法，因為此方法較凝固法特異性和準確度好。2006年Plebant M對實驗室檢查中的誤差進行分析，發(fā)現(xiàn)分析前產(chǎn)生的誤差約占 46%~68.2%[14]，2009年Lippi總結為分析前誤差是實驗室產(chǎn)生的主要誤差[15]。蛋白C檢測所需要的標本類型為枸櫞酸鈉抗凝血漿，若標本中含有凝塊，會導致結果假性升高，如用血清或者肝素抗凝的標本，檢測結果會偏高，而EDTA抗凝血會使結果減低[16]。實驗室在檢測過程中要有室間質評，目前本實驗室采用的室間質量控制為美國病理家協(xié)會(CAP)提供的樣本。在結果的回報中包含了數(shù)值和判斷結果為正?；蛘弋惓?，這就要求每個實驗室要有自己的正常人群參考值，可以為自己統(tǒng)計或者依據(jù)文獻報道進行驗證的結果。

顯色底物法較凝固法穩(wěn)定性要好，但實驗室的各種因素仍會影響其精密度，比如試劑的穩(wěn)定性、分析儀的選擇、環(huán)境因素、操作者的技能等。因此為了降低系統(tǒng)誤差，要定期對儀器進行校準。

值得注意的是蛋白C缺乏的攜帶者其蛋白C活性及抗原數(shù)量與正常人接近，如要對其分析，需要采用蛋白C/[(FⅡ抗原+FⅩ抗原)/2]的比值與正常人群進行比較。在急性血栓形成時檢測的蛋白C是不能判斷其是否為蛋白C缺乏癥的，Kovacs對254例靜脈血栓栓塞患者進行了比對試驗，在發(fā)生栓塞的24小時內檢測其蛋白C，發(fā)現(xiàn)有10例蛋白C水平極低；對這10例進行跟蹤，當患者抗血栓治療后，重復檢測發(fā)現(xiàn)其中的6例蛋白C水平正常[17]。因此在血栓形成傾向的檢測試驗中，建議急性血栓時期蛋白C的檢測結果僅作為參考，在對此類患者的靜脈血栓治療不應考慮蛋白C的結果[18]。

對于純合子的蛋白C缺乏癥或者新生兒DIC患者，檢測蛋白C時，其方法的靈敏度下限要小于正常值的5%。有報道稱ELISA方法的靈敏度最好，可以準確檢測出小于5%的蛋白C樣本。凝固法分析通常是將樣本進行5倍或10倍稀釋，如對于低值樣本，可進行2倍或3倍的稀釋，這樣可提高靈敏度。顯色底物法檢測低值樣本其靈敏度是最不理想的，因為檢測時沒有預稀釋，在低值標本中的本底效應就會凸現(xiàn)出來，要將本底排除再進行分析。因此在檢測低值樣本時，首先要確定檢測方法的靈敏度，才能報告準確的結果。

蛋白C檢測結果較低時應考慮：包括純合子及雜合子在內的先天性的蛋白C缺乏；幼兒生理性低值；維生素K缺乏癥；維生素K抵抗；肝臟疾??；腎臟疾病；彌漫性血管內凝血(DIC)；靜脈血栓患者；自身免疫性疾?。惶於０访钢委煹幕颊遊19]。

總之雖然蛋白C檢測有各種因素的影響，但其在蛋白C缺乏癥的診斷及血栓性疾病的原因分析中有重要的作用。對其基因突變的分析也將成為研究熱點，以彌補中國漢族人群的基因背景，為基因診斷提供依據(jù)。

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