傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的研究現(xiàn)狀

徐丹萍，蒲 彪，* ，敖曉琳，陳安均，卓志航

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川雅安625014)

泡菜以清脆、開胃、滋味爽口著稱，在中國已有大約3000 多年的歷史［1］。泡菜是以新鮮蔬菜為原料，在乳酸菌和酵母菌等菌群的作用下通過厭氧發(fā)酵而成的一種發(fā)酵食品［2］。乳酸菌作為優(yōu)勢菌種，在泡菜的整個(gè)發(fā)酵過程中起到非常重要的作用，乳酸菌在各個(gè)階段的種類及數(shù)量的多少直接關(guān)系到泡菜的品質(zhì)［3］。因此，研究傳統(tǒng)泡菜中的乳酸菌，對于進(jìn)一步深入研究泡菜的微生態(tài)機(jī)理，建立微生態(tài)與風(fēng)味物質(zhì)形成關(guān)系模型及可控調(diào)節(jié)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、自動化生產(chǎn)具有重要的意義。本文從乳酸菌發(fā)酵對泡菜風(fēng)味品質(zhì)的影響和風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)檢測技術(shù)、乳酸菌在發(fā)酵過程中的消長規(guī)律、乳酸菌的分類鑒定以及優(yōu)良發(fā)酵劑的開發(fā)幾個(gè)方面歸納綜述了傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的研究現(xiàn)狀。

1 乳酸菌發(fā)酵對泡菜風(fēng)味品質(zhì)的影響及風(fēng)味物質(zhì)檢測技術(shù)

泡菜風(fēng)味的形成是一系列生物化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，乳酸菌發(fā)酵不僅使泡菜形成了獨(dú)特的風(fēng)味，而且其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些抗菌物質(zhì)保證了泡菜的品質(zhì)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)被用于風(fēng)味物質(zhì)的檢測，一定程度的提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性。

1.1 影響泡菜風(fēng)味品質(zhì)的主要成分及其形成機(jī)理

乳酸菌對葡萄糖利用的作用方式主要有同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵。同型乳酸發(fā)酵中，乳酸菌利用葡萄糖生成中間產(chǎn)物丙酮酸，進(jìn)一步在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸;異型乳酸發(fā)酵的終產(chǎn)物主要包括乙醇、乙酸、二氧化碳等［4］。除了對葡萄糖的利用之外，乳酸菌還可以利用果糖、蔗糖等其他糖類，以及蛋白質(zhì)、脂肪等，生成復(fù)雜的物質(zhì)。生成的這些物質(zhì)相互之間又可以發(fā)生進(jìn)一步的化學(xué)反應(yīng)，生成沒有揮發(fā)性的呈味成分和揮發(fā)性香氣成分［5-6］。

泡菜中的呈味成分主要有有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸等。一部分有機(jī)酸來源于蔬菜本身，例如酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸等［7］。另一部分有機(jī)酸則主要來源于乳酸菌的同型和異型發(fā)酵作用，例如乳酸、乙酸、丙酸、六碳脂肪酸等。其中，乳酸是在泡菜中含量最多的一種有機(jī)酸，具有柔和、爽口的特點(diǎn)，對泡菜風(fēng)味的形成具有重要意義。乳酸菌對蛋白質(zhì)的水解能力較弱，但仍可以通過自身的酶解系統(tǒng)對鮮味物質(zhì)的含量產(chǎn)生重要影響［8］。周相玲［9］曾報(bào)道，對比發(fā)酵前后泡卷心菜中游離氨基酸的含量發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵之后泡菜中總氨基酸含量降低，但是部分呈味氨基酸的含量增加，例如天門冬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等。泡菜中核苷酸主要來自蔬菜本身和發(fā)酵液中微生物細(xì)胞的自溶，因此核苷酸的含量與蔬菜的種類及微生物的自溶度關(guān)系密切［10］。

揮發(fā)性香氣成分以硫化物、氰化物、酯化物、醛、醇等為主。陳功等［11］對四川泡菜中風(fēng)味物質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性成分中醇、醛、酮、烯等占揮發(fā)性物質(zhì)總量的90%。醛是泡菜中非常重要的一種揮發(fā)性物質(zhì)，對泡菜湯汁的影響較大。硫化物是泡菜中主要的風(fēng)味物質(zhì)，但是在發(fā)酵前后，硫化物的種類及含量均發(fā)生了變化［9］。酯化物一般來源于醇與酸的酯化反應(yīng)，同樣在揮發(fā)性成分中占有較大比例［12］。據(jù)報(bào)道，許多乳酸菌可以利用檸檬酸產(chǎn)生丁二酮和乙偶姻［13］。

發(fā)酵過程產(chǎn)生的酸、二氧化碳、過氧化氫等在一定程度上能夠使泡菜具有食用安全性。另外，一些抑制有害菌群繁殖的抗菌成分的產(chǎn)生進(jìn)一步保證了泡菜的品質(zhì)，例如細(xì)菌素等［14］。

泡菜中微生物的活動以及各種物質(zhì)間的相互作用使泡菜形成了非常復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)和優(yōu)良的品質(zhì)。

1.2 風(fēng)味物質(zhì)主要檢測技術(shù)

對食品中風(fēng)味物質(zhì)檢測前，一般都需要進(jìn)行預(yù)處理。果蔬食品風(fēng)味物質(zhì)檢測常用的預(yù)處理技術(shù)主要有溶劑萃取法、同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)、頂空分析法(HS)、固相微萃取法(SPME)等。SPME 是近年來新發(fā)展起來的一種預(yù)處理技術(shù)，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，具有獨(dú)特的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味物質(zhì)檢測領(lǐng)域［15］。

風(fēng)味物質(zhì)的檢測常采用一種技術(shù)或者幾種技術(shù)相結(jié)合方法。食品領(lǐng)域常用的風(fēng)味物質(zhì)檢測技術(shù)主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、氣相色譜-聞香法(GC-O)、電子鼻等。這些檢測技術(shù)對泡菜風(fēng)味品質(zhì)的控制具有重要意義。GC 主要用于檢測食品中的揮發(fā)性成分和半揮發(fā)性成分，但其定性功能受操作條件影響較大，因此常與SPME 和MS 聯(lián)用，達(dá)到較好的定性和定量功能［16］。HPLC 具有高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，對食品中有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖等的檢測效果比較好［17］。食品中一些風(fēng)味物質(zhì)，含量雖然很少，但對風(fēng)味的貢獻(xiàn)不容忽視。采用通常的檢測方法進(jìn)行檢測時(shí)，由于物質(zhì)含量低于儀器的檢出限而無法準(zhǔn)確檢出，卻很容易被人的鼻子嗅出。GC-O 檢測方法通過氣相色譜將風(fēng)味物質(zhì)分離開，再分流進(jìn)入嗅探裝置，以人的鼻子為檢測器，實(shí)現(xiàn)風(fēng)味成分的準(zhǔn)確檢出［18］。電子鼻是近年來發(fā)展起來的一種新的檢測技術(shù)，以模擬動物嗅覺器官為原理，獲得被測樣品中風(fēng)味物質(zhì)的“指紋”數(shù)據(jù)，具有方便快捷、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［19］。目前，在果蔬、酒類、肉類、飲料、茶葉、香料等的品質(zhì)和風(fēng)味檢測方面應(yīng)用廣泛。Zhang 等［20］利用電子鼻檢測技術(shù)和統(tǒng)計(jì)分析建立了桃子的品質(zhì)指數(shù)模型并成功地預(yù)測了不同桃子的采摘日期，發(fā)現(xiàn)電子鼻在通過風(fēng)味變化評估果品品質(zhì)方面具有很大優(yōu)勢。

利用高新技術(shù)檢測泡菜中風(fēng)味物質(zhì)，對于泡菜風(fēng)味圖譜的完善、泡菜產(chǎn)品的開發(fā)等具有重要意義;通過檢測泡菜在不同貯藏時(shí)期的風(fēng)味變化，有助于對泡菜品質(zhì)的控制。

2 乳酸菌在發(fā)酵過程中的消長規(guī)律

泡菜發(fā)酵的過程中，乳酸菌的種類和數(shù)量受到所處環(huán)境的影響，例如溫度、鹽濃度、配料、發(fā)酵時(shí)間、其他微生物群落等［21］。

新鮮蔬菜表面所攜帶的菌群數(shù)量大約有5.0 ～7.0logcfu·g-1［22］，并以好氧菌群為主，乳酸菌只占到很少的一部分(2.0 ～4.0logcfu·g-1)［23］。這些菌受到環(huán)境的影響且菌群密度不大，所以一般不會對健康構(gòu)成威脅。但是當(dāng)環(huán)境條件改變時(shí)，菌落構(gòu)成及菌群數(shù)量將發(fā)生改變。泡菜的早期發(fā)酵主要是利用新鮮蔬菜表面的菌群來進(jìn)行的。

發(fā)酵早期，因受到鹽濃度影響，蔬菜里的可溶性營養(yǎng)成分進(jìn)入發(fā)酵液，此時(shí)酵母菌及其他腐敗菌群開始繁殖，生成一些有機(jī)酸和二氧化碳等。隨著環(huán)境條件的改變，這些菌群很快死亡，腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)成為啟動泡菜發(fā)酵的一類乳酸菌［24］。腸膜明串珠菌進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，積累有機(jī)酸并形成了厭氧環(huán)境。進(jìn)入發(fā)酵中期，耐酸且不產(chǎn)氣的一類乳酸菌尤其是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和短乳桿菌(Lactobacillus brevis)逐漸成為優(yōu)勢菌群［25-26］。這個(gè)時(shí)期，乳酸菌群的數(shù)量達(dá)到最大，乳酸的積累量達(dá)到0.4%～0.8%［27］。發(fā)酵后期，當(dāng)乳酸積累量達(dá)到一定濃度時(shí)，乳酸菌的活動開始受到抑制，而非產(chǎn)酸的真菌繁殖，使泡菜出現(xiàn)品質(zhì)下降甚至腐敗的現(xiàn)象［28］。

3 乳酸菌的分類鑒定

乳酸菌的分類鑒定一般有傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)方法根據(jù)微生物的細(xì)胞形態(tài)、生活習(xí)性和及生理生化特征進(jìn)行鑒定研究。但是自然界中很多微生物不能被培養(yǎng)［29］，傳統(tǒng)方法能夠分離培養(yǎng)的微生物的數(shù)量不足自然界中微生物總量的1%［30］。目前對傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌分類鑒定的研究途徑一般采用分子生物學(xué)方法或者傳統(tǒng)方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合。常用的分子生物學(xué)方法主要有:G +C 含量測定、16S rDNA 序列分析、16S～23S rDNA 基因間隔區(qū)序列分析、基于PCR 技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)、DNA雜交技術(shù)、宏基因組技術(shù)等。

乳酸菌的分類鑒定對于泡菜中優(yōu)勢乳酸菌的篩選具有重要意義，同時(shí)能夠發(fā)現(xiàn)更多未知的生物信息，豐富乳酸菌的多樣性。

[5]This conduct threatens our national interests,undermines the value of U.S.investments and technology,weakens the global competitiveness of our firms,and harms American workers.（2018.3.23）

篩選優(yōu)勢乳酸菌是開發(fā)優(yōu)良接種劑的基礎(chǔ)，為規(guī)?；a(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)支持。優(yōu)勢菌種的篩選一般以產(chǎn)酸速度、發(fā)酵風(fēng)味、降解亞硝酸鹽能力等作為指標(biāo)。敖曉琳等［31］以產(chǎn)酸速度和發(fā)酵風(fēng)味為篩選指標(biāo)對優(yōu)勢菌株通過16S rRNA 序列分析進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)和植物乳桿菌。不同的實(shí)驗(yàn)之間因發(fā)酵蔬菜品種、制作工藝以及鑒定方法等的不同使篩選得到的優(yōu)勢菌株存在一定的差異。以泡菜的安全性為出發(fā)點(diǎn)，采用API 50 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對篩選得到的乳酸菌鑒定發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和歧異肉食桿菌(Carnibacterium divergens)降解亞硝酸鹽的能力較強(qiáng)且生物胺產(chǎn)生量較少［32］。通過對泡菜中優(yōu)勢乳酸菌的分離鑒定發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬 (Lactobacillus )、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)為泡菜中的主要優(yōu)勢菌群［33-34］。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，泡菜中越來越多的乳酸菌被鑒定出來。據(jù)報(bào)道，以16S rRNA 基因序列分析方法分析發(fā)酵甘藍(lán)鹵水中乳酸菌的多樣性，得到了用常規(guī)分離培養(yǎng)方法無法鑒定的 Lactobacillus acidifarinae［35］。盛海圓［34］對泡菜中乳酸菌多樣性進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)有Lactobacillus namurensis 存在。近年來，宏基因組技術(shù)得到不斷發(fā)展，其在新基因的發(fā)現(xiàn)、微生物活性物質(zhì)的篩選、微生物分子生態(tài)學(xué)研究、生物降解作用研究等領(lǐng)域體現(xiàn)出越來越重要的作用［36］。宏基因組技術(shù)通過提取環(huán)境樣品中總DNA并建立宏基因文庫、篩選目的基因來實(shí)現(xiàn)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源的開發(fā)利用，在微生物多樣性研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。代道芳［37］利用宏基因組學(xué)技術(shù)原理對傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌多樣性研究，對經(jīng)變性梯度凝膠電泳(DGGE)得到的譜帶進(jìn)行測序，得到條帶A、D、E、F 分別與保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp )、漫 游 球 菌 (Planococcaceae bacterium)、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)的相似性達(dá)到100%，揭示了泡菜中豐富的乳酸菌資源。

4 優(yōu)良泡菜發(fā)酵劑的開發(fā)

開發(fā)優(yōu)良發(fā)酵劑不僅可以提高生產(chǎn)效率，而且能夠通過適當(dāng)?shù)木昱浔?，發(fā)酵制得風(fēng)味好、品質(zhì)佳、有害因素含量低的泡菜。優(yōu)良發(fā)酵劑的開發(fā)可以從泡菜中原有的菌種中進(jìn)行篩選，也可以通過誘變育種進(jìn)行選育。

4.1 產(chǎn)酸速度快、風(fēng)味優(yōu)的發(fā)酵劑開發(fā)

以產(chǎn)酸速度和發(fā)酵風(fēng)味作為指標(biāo)是開發(fā)泡菜發(fā)酵劑的常用方法。產(chǎn)酸速度快的菌株能夠縮短發(fā)酵周期，利于在工業(yè)化生產(chǎn)中降低生產(chǎn)成本。以白菜為發(fā)酵原料，楊曉暉等［38］得到接種干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei subsp.Casei)和植物乳桿菌1天之后，pH 迅速降至3.30 左右。袁亞等［39］在實(shí)驗(yàn)中以植物乳桿菌和干酪乳桿菌作為接種劑進(jìn)行研究，得到當(dāng)兩者比例在2∶1 時(shí)，泡菜發(fā)酵時(shí)間短、風(fēng)味好且亞硝酸鹽含量低。對乳酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，莫祺紅［40］得到凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)在鹽濃度為4%、接種量為5%、25℃溫度下發(fā)酵3 天的條件下發(fā)酵風(fēng)味最佳，亞硝酸鹽濃度最低。

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)使微生物能夠感應(yīng)外界環(huán)境信號并啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)和產(chǎn)物的修飾［41］。因此，通過一定方法改變外界環(huán)境，可以使微生物朝著預(yù)期的方向變異。為了得到產(chǎn)酸能力高的菌種作為接種劑，劉月英等［42］采用紫外線照射和NTG 作為誘變劑的方法對乳酸菌進(jìn)行選育，得到了比原菌株產(chǎn)酸能力提高30.64%的菌株，且具有較好的遺傳穩(wěn)定性。乳酸菌的自溶不但能夠產(chǎn)生一定的營養(yǎng)物質(zhì)，而且可以為其他微生物的生長提供必要的營養(yǎng)供給［43］。因此，適當(dāng)提高乳酸菌自溶度并使其控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，在增加泡菜營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)可以提升泡菜的風(fēng)味和口感。孫潔等［44］利用N+注入誘變的方式，篩選得到自溶度提高127.98%和115.11%的菌株LD3-A3 和GS1-B13，為乳酸菌接種劑的開發(fā)提供了一定的方法和數(shù)據(jù)。

4.2 亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)的發(fā)酵劑開發(fā)

亞硝酸鹽在泡菜發(fā)酵的過程會出現(xiàn)一個(gè)峰值，影響了泡菜的食用安全性和發(fā)展前景。開發(fā)具有降解亞硝酸鹽能力的功能性菌株，對泡菜的推廣十分重要。龔鋼明等［45］從傳統(tǒng)泡菜中分離出降解亞硝酸能力較強(qiáng)的菌株，實(shí)驗(yàn)證明乳桿菌屬的兩株菌株c2和h2 在24h 內(nèi)對亞硝酸鹽的降解量分別達(dá)到49.03μg/mL 和36.96μg/mL，片球菌屬的一株菌株c2的降解量為35.11μg/mL，為具降解亞硝酸鹽能力的發(fā)酵劑的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。據(jù)報(bào)道，腸膜明串珠菌和短乳桿菌接種比例為1∶3 時(shí)，亞硝酸鹽在整個(gè)發(fā)酵過程中的含量最低［46］。以500～600g 白菜為主要發(fā)酵原料，通過接種2～4g 短乳桿菌，并加入適量維生素C、檸檬酸等，王彪等［47］得到了低亞硝酸鹽含量的泡菜的制作方法。

乳酸菌能夠降解亞硝酸鹽的主要原因是其在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶，亞硝酸鹽還原酶還原亞硝酸鹽生成氨［48］。通過直接篩選產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶能力高的菌株作為發(fā)酵劑也是開發(fā)泡菜優(yōu)良發(fā)酵劑的一種方法。研究發(fā)現(xiàn)，對通過篩選得到的產(chǎn)酶能力較高的短乳桿菌進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，其在最優(yōu)條件下產(chǎn)生酶的濃度比優(yōu)化前高出58.06%［49］。目前，通過誘變方法篩選產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶能力較高的乳酸菌的研究報(bào)道相對不多，誘變篩選將成為今后開發(fā)強(qiáng)降解亞硝酸鹽發(fā)酵劑的一個(gè)方向。

5 展望

a.從微生態(tài)領(lǐng)域研究乳酸菌發(fā)酵過程，探究風(fēng)味、品質(zhì)形成與乳酸菌發(fā)酵的深層次關(guān)系，建立風(fēng)味物質(zhì)和特征性物質(zhì)圖譜以及乳酸菌動力學(xué)模型。

b.運(yùn)用先進(jìn)技術(shù)發(fā)掘泡菜中更多的乳酸菌種類，揭示未培養(yǎng)乳酸菌對泡菜品質(zhì)的影響。

c.通過各種先進(jìn)手段開發(fā)適合泡菜發(fā)酵并對泡菜品質(zhì)產(chǎn)生積極影響的直投式乳酸菌接種劑，并對接種劑的保藏條件進(jìn)行深入研究。

d.建立工業(yè)化生產(chǎn)中的乳酸菌可控系統(tǒng)，為實(shí)現(xiàn)中國傳統(tǒng)泡菜的自動化、現(xiàn)代化打下基礎(chǔ)。

隨著科技的進(jìn)步以及對泡菜和其中乳酸菌研究的不斷深入，相信中國泡菜將最終實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；约皣H化。

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