凍干活疫苗中保護劑的作用及研究

北京天壇生物制品股份有限公司（100024）孫旭東 陳更新

保護劑是凍干活疫苗中不可或缺的一部分。保護劑作用有以下幾點：①具有保護病毒及細菌活力、抗原穩(wěn)定性、耐干燥和冷凍的低分子物質(zhì)和形成凍干活疫苗耐熱性結構的有機高分子物質(zhì)；②具有高度抗氧化作用的抗氧化劑，能夠最大限度地消耗溶液中溶解的氧，減少病毒或細菌與氧的接觸，降低病毒或細菌的代謝活力和能量損耗，防止其在冷凍干燥及儲運過程中死亡；③根據(jù)保護劑中的每一種物質(zhì)的共融點進行大量反復凍干試驗，科學地確定每一種活疫苗的凍干曲線，使病毒或細菌在凍干過程中的失活率降到最低程度，也使凍干活疫苗形成良好的物理性狀。

1 冷凍干燥技術介紹

冷凍干燥技術是目前保持微生物、動物組織、細胞及蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)生物活性的一個有效的、普遍的方法。在一定的真空條件下，制品溶液預先凍結成固體，然后在低溫低壓條件下，從凍結狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方法。此過程即稱為冷凍干燥，簡稱凍干，是冷凍和干燥的結合[1]。

2 冷凍干燥對疫苗的損傷

在真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥不可避免地會造成部分微生物細胞的損傷及死亡，導致蛋白質(zhì)變性[2]。為提高和保證凍干活疫苗的存活率與生物活性，人們進行了大量的研究，其中包括凍干過程中蛋白質(zhì)的空間結構變化，各種保護劑對蛋白質(zhì)的影響。蛋白質(zhì)的折疊與展開狀態(tài)的平衡受周圍物理環(huán)境（例如pH值、溫度、溶劑成分、水合水平等）的影響很大。

從二十世紀六、七十年代開始，國外一些學者對凍干蛋白質(zhì)的變性機理進行研究，當時認為變性主要發(fā)生在冷凍過程。從二十世紀八、九十年代至今，普遍認為在冷凍干燥過程中，冷凍和干燥都會引起蛋白質(zhì)變性[3]。冷凍變性機理是冷凍過程中結晶引起水的狀態(tài)和結構的變化，是蛋白質(zhì)變性的主要原因，并且蛋白質(zhì)變性的程度依賴于冷凍的程度，冷凍溫度越低，蛋白質(zhì)變性越劇烈。在低溫下有序的水的結構引起蛋白質(zhì)分子中疏水鍵的破壞是導致蛋白質(zhì)變性的主要原因。蛋白質(zhì)分子周圍分布著多層水分子，在降溫過程中，蛋白質(zhì)分子周圍的水分子不斷凍結，但只要蛋白質(zhì)分子表面的單層水分子沒有凍結，蛋白質(zhì)就不會變性，反之亦然。干燥變性機理是干燥過程的變性，主要是發(fā)生在二次干燥階段即移去結合水的階段。蛋白質(zhì)在水溶液中是水化的，表面有一層水分子包圍，構成一個單層分子，這就是水化層。這層水分子通過氫鍵和蛋白質(zhì)相互作用連接。干燥過程要移去一部分水化層的水，破壞蛋白質(zhì)表面的氫鍵結構，引起天然結構的變性。

3 保護劑作用機理

凍干活疫苗的整個凍干過程存在著各種各樣的應力，通常包括低溫應力、凍結應力（包括枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等）、干燥應力（移去蛋白質(zhì)表面單層水分子）等，這些應力常常是直接或間接導致生物制品不穩(wěn)定的因素[4]。保護劑可以改變疫苗冷凍干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持生物樣品原有的各種理化特性和生物活性，同時對產(chǎn)品貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)變性起到抑制作用[5]。

4 保護劑介紹

常用在凍干活疫苗中的保護劑種類有：多羥基化合物、糖、蛋白質(zhì)、聚合物、氨基酸、鹽、表面活性劑等。

4.1多羥基化合物 多羥基化合物是保護劑中重要成分之一，常見的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、側金盞花醇等[6]。多羥基化合物的保護機理：由于疫苗蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接，當凍干過程中脫水后，多羥基化合物的羥基能替代蛋白質(zhì)表面的水分子的羥基，與蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，從而保護氫鍵的連接位點不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結構，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性。

4.2糖 糖是凍干活疫苗中最常見的保護劑，使用最廣的一類必要成分，為蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑。在凍干及保存各階段均能對生物制品起到一定的保護作用。糖的保護作用與其及蛋白質(zhì)的種類有關[7]。常見的有蔗糖、乳糖、海藻糖、菊糖、糊精等。糖的保護作用：二糖對阻止蛋白質(zhì)二級結構的改變、凍干處理過程中及貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)多肽鏈的伸展和聚集起著顯著作用。二糖中的蔗糖和海藻糖是研究最多、也是公認最有效的保護劑。

4.3蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)保護劑是保護劑的重要組分。蛋白質(zhì)類保護劑根據(jù)來源可分為兩種：動物源性蛋白質(zhì)和外來蛋白質(zhì)。血清白蛋白是一個經(jīng)典-優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，人血清白蛋白則在更低濃度（＜0.05%～0.1%）時能有效阻止蛋白質(zhì)表面的吸附，對凍干過程中多數(shù)蛋白都具有保護作用。目前，也有報道稱重組人白蛋白推薦為血清白蛋白的替代品[8]。

4.4聚合物 聚合物作為大分子物質(zhì)保護劑，要與小分子物質(zhì)聯(lián)合使用，常見的有聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明膠、聚乙烯亞胺。通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質(zhì)，如優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面析出、表面活性、使蛋白質(zhì)溶液濃度升高從而阻止其他小分子（如糖及多羥基化合物）的結晶、抑制冷凍過程中pH值的劇烈變化等。

4.5氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)保護劑常見的一種，常用的氨基酸類保護劑有精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸等。在冷凍過程中的主要作用是能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起蛋白質(zhì)結構的破壞[9]。

5 保護劑的選用

要想獲得穩(wěn)定的活疫苗凍干制品，保護劑的選用至關重要。保護劑的選取對提高其穩(wěn)定性尤為重要。一個優(yōu)良的保護劑要對保持疫苗的玻璃化有利，因為玻璃化的疫苗不僅復溶速率高，物理性狀好，而且質(zhì)量穩(wěn)定性高。要對被保護的疫苗物理化特性有了解，通過試驗摸索出在凍干過程及貯藏過程中導致該疫苗不穩(wěn)定的因素。然后針對這些不穩(wěn)定性因素選擇具體的保護劑。大量實驗證明，糖及多羥基化合物是最常用的保護劑。其中蔗糖對一些蛋白質(zhì)能顯示出很好的保護作用，故在選取保護劑時要優(yōu)先考慮。使用任何一種保護劑不能對活疫苗起到所有的保護，因此還得考慮兩種或兩種以上的保護劑的使用。在考慮使用多種保護劑時，不同種類的保護劑能起到顯著的保護效果。此外，原輔材料的選購、配制、滅菌、保存和使用，對于凍干活疫苗的質(zhì)量起著至關重要的作用，如在保護劑配制過程中，使用不同廠家生產(chǎn)的原材料進行活疫苗的凍干，結果可導致疫苗在耐老化試驗后效力檢驗達不到質(zhì)量標準的要求。此外，原輔材料中的雜質(zhì)也會對凍干活疫苗的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。保護劑通常有一個最佳的使用濃度，所以需要摸索合理的配比使用量。保護劑的配制對活疫苗的穩(wěn)定性同樣有重要作用。在配制過程中應注意以下幾點：①配制用水的標準；②稱量的準確度；③保護劑的溶解順序；④大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)混合比例；⑤保護劑貯存溫度。以上任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能會影響保護劑的性能，導致保護劑失去保護病毒的作用，從而導致活疫苗質(zhì)量的不穩(wěn)定。

6 小結

在凍干前，疫苗要經(jīng)過配液、過濾及分裝等過程，期間疫苗處于水溶液這一相對不穩(wěn)定狀態(tài)，即使相對較短時間，也可能發(fā)生降解反應。因此應加快各操作步驟，盡量縮短該過程持續(xù)時間，以防溶質(zhì)發(fā)生沉淀，進而導致疫苗穩(wěn)定性降低。

保護劑因其獨特的生產(chǎn)工藝條件，為許多活疫苗特別是對溫度敏感的抗原和水溶液中不穩(wěn)定的抗原提供了穩(wěn)定的制備方法，發(fā)展十分迅速。但冷凍干燥是一個伴隨有熱質(zhì)轉換發(fā)生的非常復雜的物理化學變化過程，在凍干過程中冷凍濃集引起的高鹽濃度、pH值變化和干燥失水引起的表面作用都會對疫苗抗原結構穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。除此以外，對疫苗穩(wěn)定性有重要影響的因素還有水分含量、保護劑結晶等。

為了提高活疫苗的穩(wěn)定性，對凍干生產(chǎn)工藝和保護劑選擇進行了大量的研究，其中保護劑的選取對提高其穩(wěn)定性尤為重要。一個優(yōu)良的保護劑要對保持疫苗的玻璃化有利，因為玻璃化的疫苗不僅復溶速率高，物理性狀好，而且質(zhì)量穩(wěn)定性高。目前，已掌握了一些保護劑的作用機制，但不同的抗原穩(wěn)定性不同。仍需要進一步深入研究保護劑機理，最終提供滿足不同條件的有效穩(wěn)定的保護劑，為生產(chǎn)出質(zhì)量合格穩(wěn)定的凍干活疫苗提供保障。