桑葉及桑葉茶中脫氧野尻霉素及其影響因素的研究進(jìn)展

肖 洪，羅金鳳，黃先智，丁曉雯，*，任美燕，曾藝濤，秦櫻瑞，楊 娟

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；2.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400715）

桑葉為?？浦参锷５娜~，中醫(yī)又名“鐵扇子”，桑葉在中國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中可用以治療消渴癥，醫(yī)書《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》中均有相關(guān)記載，是重要的醫(yī)療藥物和保健食品原料。桑葉茶是由桑葉加工制作而成的新型茶品，其中桑葉綠茶甘醇香甜；桑葉烏龍茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑紅茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。桑葉茶及其原料桑葉中含有豐富的DNJ，而普通的茶葉中卻不含DNJ。DNJ賦予了桑葉和桑葉茶降血糖[2]、降血脂[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]等重要保健作用。本文綜合了影響桑葉和桑葉茶保健成分脫氧野尻霉素含量的因素，DNJ的保健作用，以及桑葉中DNJ的分離、純化、測(cè)定方法，為合理開發(fā)桑葉資源和DNJ提供參考。

1 桑葉及桑葉茶主要的成分和優(yōu)勢(shì)

桑葉營養(yǎng)成分豐富，每100g干物質(zhì)中含粗蛋白15.3～30.9g、粗脂肪2.1～7.9g、碳水化合物9.7～39.7g、膳食纖維27.6～43.6g[6]。而桑葉茶中富含Zn、Mg、Ca、K、Mn、Cu等礦物元素，桑葉茶的礦物元素含量及比例明顯優(yōu)于茶葉，其中K、Ca、Mg含量較高分別為2.9、1.1、0.5g/100g，比茶葉高出3～6倍；桑葉茶中總糖（4.7g/100g）、酚類物質(zhì)（5.1g/100g）、氨基酸（3.5g/100g）含量較大；同時(shí)桑葉葉面較薄水浸出物較多，比茶葉易溶解出有效成分，更有利于人體的吸收[7]。此外桑葉和桑葉茶中還含有γ-氨基丁酸（32.5～122.4mg/100g濕重）[8-9]、褪黑激素（279.6～384.4ng/g干重）[10]、黃酮苷[11-12]、α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制劑[13]，以及生物堿、茶多酚，花青素、綠原酸、白藜蘆醇、氧化芪三酚、β-胡蘿卜素等生物活性成分[14-15]。

2 影響脫氧野尻霉素（DNJ）含量的因素和DNJ的保健功能

2.1 影響DNJ含量的因素

2.1.1 桑樹品種和產(chǎn)地 對(duì)泰國的35個(gè)桑樹品種研究發(fā)現(xiàn)，桑嫩葉中DNJ含量為30～170mg/100g干重，Kam、Burirum 60 和Burirum 51中DNJ含量較高，其中Burirum 60嫩芽中DNJ含量高達(dá)300mg/100g干重[2]。Meng等也研究發(fā)現(xiàn)中國不同產(chǎn)地的桑葉中DNJ含量差異顯著，其中海南的瓊41和陜西的豬桑DNJ的含量最高，分別為0.344%和0.309%，而江蘇的湖桑32號(hào)（0.08%）和新疆的疏勒白桑（0.086%）DNJ含量比較少，而來自同一地區(qū)的不同品種桑葉中DNJ含量也有差異，如其中均來自四川省的桑葉品種DNJ含量最高達(dá)0.256%，最低僅為0.111%[16]。

2.1.2 季節(jié) 桑葉中的DNJ含量與季節(jié)相關(guān)，在5月桑葉中DNJ平均含量0.052%±0.029%（n=82），7月桑葉中DNJ平均含量為0.063%±0.029%（n=83），8月平均含量為0.071%±0.037%（n=82）；在5月大多樣品中DNJ含量在0.04%～0.06%，所有樣品中DNJ含量沒有超過0.14%，7月大多樣品中DNJ含量集中在0.02%～0.04%，3種樣品中DNJ含量超過0.14%，但在8月大多樣品中DNJ含量0.06%～0.08%，4種樣品中DNJ含量超過0.14%，因此8月采摘桑葉可以獲得較高含量的DNJ[17]。

2.1.3 施氮量和氮元素形態(tài) YIN Hao等[18]研究了施氮量及氮元素形態(tài)（NO3-和NH4+）對(duì)桑葉中DNJ含量的影響，發(fā)現(xiàn)兩種氮肥（NH4+-N和NO3--N）的加入，隨著施氮量的增加，桑葉中的DNJ含量先增加后降低，這可能是因?yàn)橐缘獮榛A(chǔ)的次生代謝物質(zhì)（如生物堿、DNJ等含氮化合物）與植物體內(nèi)C/N比呈負(fù)相關(guān)；與NH4+-N對(duì)比NO3--N更有利于桑葉中DNJ的積累；當(dāng)NH4+-N∶NO3--N=25∶75時(shí)，桑葉中的DNJ含量達(dá)到最高，因此氮形式和氮含量會(huì)對(duì)桑葉中DNJ的含量有影響。

2.1.4 光照強(qiáng)度 殷浩等[19]研究了光照強(qiáng)度對(duì)桑葉中DNJ含量的影響，發(fā)現(xiàn)遮陰處理能顯著增加桑苗葉的DNJ含量，當(dāng)遮陰程度增加時(shí)，DNJ含量明顯增加；桑苗葉片在25%光強(qiáng)下處理5d，桑苗葉片中DNJ含量最高可達(dá)0.2043%；在處理15d時(shí)，桑葉中DNJ含量比100%光強(qiáng)下增加幅度大，高達(dá)60.63%；而遮陰5d后，繼續(xù)遮陰卻對(duì)桑葉中DNJ含量基本沒有影響。

2.1.5 金屬元素和維生素 研究發(fā)現(xiàn)，采用MS培養(yǎng)基，適當(dāng)提高果糖和無機(jī)鹽濃度，降低磷酸鹽濃度等，有利于桑苗葉片中DNJ的合成和積累；培養(yǎng)基中的Fe2+濃度對(duì)桑苗葉片中DNJ的含量有顯著影響，無Fe2+時(shí)不能合成DNJ，F(xiàn)e2+濃度在0.05～0.20mmol/L范圍內(nèi)，DNJ的含量隨著Fe2+濃度增加有所降低，培養(yǎng)基中的煙酸、維生素B6對(duì)于桑苗葉片中DNJ的合成具有抑制作用，而Mg2+、肌醇、維生素B1和甘氨酸等對(duì)DNJ合成影響較為復(fù)雜，有一定的互作效應(yīng)[20]。

2.1.6 其他因素 LOU等[21]研究了DNJ含量與地理位置、土壤特性、氣象因素和收獲時(shí)間等因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們分別是桑芽從樹枝的頂端部分的DNJ的含量最高，其次是根，幼葉和成熟葉；桑樹成長與高緯度地區(qū)的DNJ的含量較高；堿性和低氮總含量土壤是有利于DNJ的合成；而DNJ合成高峰期為每天的06∶00至10∶00時(shí)和下午18∶00。

2.2 DNJ的保健功能

2.2.1 降血糖 桑葉茶中DNJ可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，DNJ能同小腸中的麥芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等2-糖苷酶結(jié)合，阻止了二糖分解為單糖被消化吸收，從而明顯地抑制了餐后血糖值急劇升高。通過對(duì)自愿者的研究，發(fā)現(xiàn)一次性口服0.8和1.2g富含DNJ的桑葉粉末可以顯著地抑制餐后血糖升高和胰島素的分泌[22]。因此可以用來治療糖尿病，目前許多國家將桑葉茶作為保健食品，但由于桑葉茶中的DNJ含量（100mg/100g干重）較低，而它對(duì)人體的有效劑量為6mg DNJ/60kg體重，其中DNJ含量與α-葡萄糖苷酶活性抑制有較高的相關(guān)性（r=0.84），用響應(yīng)曲面優(yōu)化提取嫩芽制作的桑葉茶中DNJ，當(dāng)提取溫度為98℃提取時(shí)間為100s可使230mL的桑葉茶中的DNJ含量達(dá)6.5mg，達(dá)到人體所需的有效劑量[2]。而Kazuhisa等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，DNJ含量與α-葡萄糖苷酶活性抑制具有相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)r=0.901，r2=0.811（n=15）。

對(duì)老鼠研究發(fā)現(xiàn)通過給禁食大鼠口服從桑葉中提取的DNJ，開始大鼠血漿中DNJ含量低于檢測(cè)限，但當(dāng)攝入30min后血漿中DNJ含量達(dá)到最高92nmol/mL，最后在小鼠的血漿中未發(fā)現(xiàn)任何DNJ的代謝產(chǎn)物，因此口服的DNJ可以完全被消化道吸收，然后快速排出體外[23]。DNJ雖然對(duì)α-葡萄糖苷酶有很強(qiáng)的抑制能力，但與其他α-葡萄糖苷酶抑制劑相比較，DNJ的吸收速率快、起效迅速，但這樣會(huì)導(dǎo)致作用持續(xù)時(shí)間短；研究發(fā)現(xiàn)羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）能顯著改善血糖中DNJ的活性，將CMC-Na與DNJ一起使用，可以減慢DNJ的吸收、增加其活性持續(xù)時(shí)間，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CMC-Na還可以改變DNJ在大鼠內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，CMC-Na可以增強(qiáng)DNJ調(diào)節(jié)血糖的水平[24]。而Kim等[25]通過老鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，從桑葉中提取的DNJ與純的DNJ相比，其吸收和排泄低于純DNJ，其吸收利用率低。

2.2.2 降血脂 Kojima等[3]用富含DNJ的桑葉提取物對(duì)人體血漿脂質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)通過對(duì)甘油三酯（TG）水平≥200mg/dL的10名受試者每天3次服用含12mg DNJ的桑葉水提取物，持續(xù)12周，發(fā)現(xiàn)人體的血清甘油三酯（TG）下降，血蛋白也發(fā)生有利的變化。用DNJ和富含DNJ的物質(zhì)喂養(yǎng)大鼠四周發(fā)現(xiàn)，DNJ和甲基-DNJ（meDNJ）可以增強(qiáng)脂聯(lián)素mRNA在白色脂肪組織中的表達(dá)，增加血漿脂聯(lián)素含量，增加腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）mRNA的表達(dá)，激活β-氧化系統(tǒng)，抑制脂質(zhì)在肝臟中的堆積，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DNJ和meDNJ的攝入沒有引起肝功能障礙也沒有減少氧化應(yīng)激[26]。

2.2.3 抗腫瘤 通過研究DNJ對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移機(jī)制，包括DNJ的抗轉(zhuǎn)移活性細(xì)胞黏附，遷移和侵襲、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）和組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2（TIMP-2）mRNA表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面的黑色素瘤B16F10細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DNJ顯著抑制侵襲、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，可顯著降低MMP-2和MMP-9活性及mRNA表達(dá)，有效地提高了TIMP-2 mRNA的表達(dá)；此外，DNJ顯著降低B16F10黑色素瘤細(xì)胞表面上的異常糖基化和唾液酸，但增加了甘露糖的水平；因此DNJ的對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移作用機(jī)制可能是減弱其活性和表達(dá)MMP-2/9、TIMP-2的mRNA表達(dá)增強(qiáng)、細(xì)胞表面結(jié)合基序的改變，這些結(jié)果表明，DNJ可能是一種有用的輔助抗轉(zhuǎn)移藥物[4]。

2.2.4 對(duì)變形鏈球菌的抑制 Islam等[27]從桑葉中分離到DNJ，然后對(duì)DNJ抑制口腔致病菌變形鏈球菌的作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)與桑葉茶粗提物相比經(jīng)純化的DNJ處理后變形鏈球菌的數(shù)量減少了8倍，可以強(qiáng)烈的抑制變形鏈球菌生物膜的活性，通過聚焦顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，DNJ扭曲了變形鏈球菌的生物膜，因此DNJ可以控制變形鏈球菌的過度生長和抑制生物膜的形成。

2.2.5 抗病毒 HIV病毒有兩個(gè)富含糖基化的環(huán)合蛋白gp120和gp140，gp120和gp140作用是介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面受體分子接觸并引起細(xì)胞融合形成合體細(xì)胞，桑葉中DNJ可以較強(qiáng)的抑制糖蛋白加工，改變gp120的糖基化，DNJ對(duì)莫洛尼鼠白血病毒（MoLV）抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNJ可以顯著抑制逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的活性，其IC50為1.2～2.5μg/mL，增加DNJ劑量，抑制力增強(qiáng)[5]。

3 DNJ的分離提取、純化技術(shù)和檢測(cè)方法

3.1 DNJ的提取

目前使用較多的DNJ的提取主要有以下幾種方法。

3.1.1 有機(jī)溶劑提取法 目前提取桑葉中DNJ最常用的方法是有機(jī)溶劑提取法，如甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑均可以用來提取桑葉中的DNJ。因?yàn)橛靡掖继崛∮盟可?，提取時(shí)間很短使得較少的水溶性雜質(zhì)溶出，同時(shí)與甲醇丙酮相比，乙醇毒性相對(duì)較小，可安全使用，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，因此乙醇提取較為常用。Islam等[27]就采用乙醇溶液對(duì)桑樹中的DNJ進(jìn)行了提取。也可以用純甲醇或甲醇-水溶液對(duì)桑葉中的DNJ進(jìn)行提取，但由于純甲純?nèi)芙庑暂^差，因此可以加入一定量的吡啶，以加快DNJ的溶解，李宏等[28]使用吡啶∶甲醇=6∶4的比例時(shí)，可以使桑葉中的DNJ較好的溶解，從而達(dá)到好的分離效果。

3.1.2 酸提取法 DNJ是生物堿類化合物，其易溶解在酸性介質(zhì)中，形成可溶性的鹽而溶出，同時(shí)酸液加熱后可以對(duì)植物細(xì)胞壁起到軟化的作用，從而使DNJ更容易被分離提??；缺點(diǎn)是對(duì)含有DNJ的提取液進(jìn)行濃縮較為困難。李繼文等[29]用0.05mol/L的鹽酸溶液25mL在80℃回流30min，經(jīng)抽濾后殘?jiān)偬崛∫淮危瑵饪s后即為DNJ提取液。馬靜等[30]對(duì)酸水提取法提取桑葉中DNJ進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，按一定比例的樣品和酸溶液混合，并且在酸浸提后加一定量的正丁醇進(jìn)行萃取，然后減壓濃縮，再加入2%鹽酸溶液洗滌，得到的濃縮液即為DNJ提取液。

3.1.3 微波/超聲波輔助提取法 與傳統(tǒng)方法相比，采用超聲波輔助提取DNJ的優(yōu)勢(shì)在于可以大大縮短提取時(shí)間，提高了有效成分的得率。鄭曉靜等[31]用超聲波輔助提取桑葉中DNJ的優(yōu)化條件為提取溫度48.58℃，超聲波處理時(shí)間40.67min，超聲波功率199.99W，固液比1∶11.97，在該條件下，DNJ的提取得率可達(dá)到99%。胡瑞君等[32]確定了DNJ的最佳提取工藝條件為：微波功率為406W、微波處理時(shí)間為1.5min、固液比（g∶mL）為1∶40、提取次數(shù)為2次。

3.2 DNJ的純化

3.2.1 液-質(zhì)聯(lián)用儀分離純化 李有貴等[33]采用液-質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS）分離純化法對(duì)粗提的DNJ進(jìn)行了純化，主要方法為：將粗提的DNJ用蒸餾水溶解后經(jīng)制備型液相色譜儀分離，質(zhì)譜引導(dǎo)，通過質(zhì)譜對(duì)收集液進(jìn)行鑒定，然后50℃恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，于-50℃下冷凍干燥成淡黃色粉末，即為DNJ。采用該方法純化的DNJ經(jīng)柱前熒光衍生-反相高效液相色譜法檢測(cè)，純度大于95%。

3.2.2 樹脂純化法 李宇亮等[34]采用732H陽離子樹脂純化DNJ，用蒸餾水洗至流出液為無色后用氨水洗脫，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮洗脫液，再正丁醇萃取，回收正丁醇，真空干燥，即得純化后的DNJ，DNJ純度可達(dá)93.2%。此外還可用磺酸型離子交換樹脂法和強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂法進(jìn)行純化。

3.2.3 反相柱色譜純化法 反相高效液相色譜是指以強(qiáng)疏水性的填料做固定相，以可以和水混溶的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的液相色譜，是應(yīng)用最廣的液相色譜方法。因?yàn)镈NJ屬于高極性化合物，所以可采用反相色譜柱進(jìn)行純化。周惠燕等[35]采用該方法對(duì)從桑葉中粗提的DNJ進(jìn)行了純化。

3.3 DNJ的檢測(cè)方法

DNJ測(cè)主要檢測(cè)方法有以下幾種。

3.3.1 柱前衍生化-高效液相色譜法 柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定桑葉中DNJ的原理是，9-芴甲基羰酰氯（FMOC-Cl）能衍生化伯胺和仲胺，生成的衍生物具有穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度，而DNJ分子中含仲胺結(jié)構(gòu)，在硼酸鹽緩沖液（pH=8.5）的條件下，加入用乙腈溶解配制的FMOC-Cl 溶液，DNJ 與FMOC-Cl 生成DNJ-FMOC絡(luò)合物，再加入甘氨酸除去多余的熒光試劑。柱前衍生化-高效液相色譜法是測(cè)桑葉中DNJ最常用的方法[29，31，33，35]。

3.3.2 HPLC-ELSD法 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）是一種新型通用的質(zhì)量型檢測(cè)器，其響應(yīng)僅和被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量成正比，不依賴物質(zhì)的官能團(tuán)和光學(xué)特性。Toshiyuki等用HPLC-ELSD法對(duì)桑葉中的DNJ進(jìn)行了測(cè)定，HPLC-ELSD法測(cè)定桑葉中的DNJ具有簡單、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)，其檢測(cè)限為100ng[36]。

3.3.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Dai等[37]用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)桑葉中的DNJ進(jìn)行了測(cè)定，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸，色譜柱為島津HRC-NH2柱，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，質(zhì)譜系統(tǒng)配備大氣壓化學(xué)電離（APCI）源，得出DNJ的保留時(shí)間為2.87min，在482～2410μg/L范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為95.8%，檢出限為53.6μg/L。

3.3.4 分光光度法 因?yàn)镈NJ分子結(jié)構(gòu)中沒有雙鍵、羰基、苯環(huán)等發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)，所以在紫外、可見光波段內(nèi)無吸收峰，不能采用常規(guī)的分光光度法檢測(cè)，但通過加入碘-碘化鉀試劑，使DNJ與碘-碘化鉀試劑反應(yīng)生成棕紅色絡(luò)合物，然后就可以在在紫外條件下檢測(cè)處DNJ的含量。但不同分光光度計(jì)選用的最大吸收波長卻有差異，主要有284nm和334nm[30，32，34]。

3.3.5 氣相色譜法和毛細(xì)管柱氣相色譜法 張曉臣[38]用氣相色譜法測(cè)定了桑葉中的DNJ，測(cè)定的色譜條件為：色譜柱OV-275，初溫130℃×3min，以30℃/min上升至170℃，維持4min；汽化室溫度200℃；檢測(cè)口溫度180℃；載氣為N2，流速40mL/min；進(jìn)樣量1μL，火焰離子檢測(cè)器（FID）。汪孟夏[39]用毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定了桑葉中的DNJ，其色譜條件為：色譜柱OV-1701，初溫285℃×5min，以10℃/min上升至295℃，維持25min，以20℃/min下降至285℃；汽化室溫度310℃；檢測(cè)口溫度310℃；氫氣流量47mL/min；進(jìn)樣量1μL，火焰離子檢測(cè)器（FID）。

4 結(jié)論

隨著人們對(duì)桑葉資源的不斷開發(fā)，各種桑葉咀嚼片、桑葉茶、桑葉超微粉、桑葉片劑、桑葉飲料等產(chǎn)品相繼問世，但對(duì)桑葉保健制品的開發(fā)絕對(duì)不限于此，隨著對(duì)桑葉的深入研究希望更多的產(chǎn)品為人類所利用。由于桑葉和桑葉茶中的DNJ可以高效的抑制小腸糖苷酶的活性，可用于治療Ⅱ型糖尿病，降低因酸中毒引起的心肌梗死發(fā)生率，抗腫瘤、降血脂，且對(duì)人體無明顯毒副作用，因此開發(fā)更多以DNJ為主要功效成分的保健食品及藥品發(fā)展前景良好。DNJ主要來源為桑葉，但利用現(xiàn)有技術(shù)找出其他能夠合成或生成DNJ的生物資源以解決DNJ來源不足問題。由于目前DNJ的生物合成機(jī)制并不完全清楚，因此探究DNJ的合成機(jī)制，以便大規(guī)模人工生產(chǎn)DNJ，以彌補(bǔ)自然DNJ資源的不足，也是以后研究的重點(diǎn)。同時(shí)期望通過不斷深入研究得到更高效、快速的分離提取、純化、檢測(cè)DNJ的方法。

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