動物源性食品中磺胺類藥物殘留前處理和檢測方法研究進展

黃 華，陳君慧，馮 楠，趙俊平，謝文東，江 英，魯 緋

（1.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041；2.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；3.北京市食品及釀酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗一站，北京100075）

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs），是指含有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，是一種用于畜禽預防和治療細菌感染性疾病的化學治療藥物，通?；煸陲暳现谢蛑苯涌诜?，由于其抗菌譜廣，價格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定等特點，成為畜禽抗感染治療中的重要藥物之一。藥物的使用不當造成其在動物組織中富集，可直接或間接地通過環(huán)境和食物鏈的作用對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，引起細菌耐藥性的增加。目前，臨床上使用的磺胺類藥物有20多種，歐盟、中國、美國、日本、國際食品法典委員會對動物源性食品中磺胺類藥物殘留規(guī)定了最大殘留限量值，嚴格控制磺胺類藥物在畜牧業(yè)中的應用。在我國，農(nóng)業(yè)部第235號公告中，規(guī)定磺胺類藥物在所有動物源性食品中的最高限量為100μg/kg[1]；歐盟及美國一些國家明確規(guī)定食品中磺胺類藥物總含量不得超過0.1mg/kg[2]；2006年，日本實行的“肯定列表制度”規(guī)定，部分磺胺藥物的殘留量需執(zhí)行“一律標準”是0.01mg/kg[3]。因此，建立先進、高效、快速的多殘留磺胺類藥物分析方法對獸藥殘留監(jiān)控的具有重要意義。

1 動物源性食品中磺胺類藥物殘留前處理研究進展

1.1 提取溶劑的選擇

食品基質(zhì)較為復雜，提取溶劑的選擇對檢測精度等至關(guān)重要?；前奉愃幬镆蚝胁被突撬岚坊仕釅A兩性，可溶解于酸、堿溶液中，大部分的磺胺類藥物pKa在5～8范圍內(nèi)，等電點為3～5，具有較高的極性，一般采用有機溶劑進行提取[4]，常用的提取溶劑主要有乙腈[5-10]、二氯甲烷[11]及混合溶劑[6，12-13]等。通過以上文獻可知，磺胺類藥物難溶于水，易溶于乙腈、二氯甲烷等有機溶劑中，因用于磺胺類藥物殘留分析的流動相一般將乙腈或甲醇作為有機相，故常采用乙腈作為提取溶劑，除此之外，添加部分甲酸或氨水可提高其提取效果。

1.2 提取方法的選擇

1.2.1 液液萃取法 液液萃取法（Liquid-liquid Extraction），是利用化合物在兩種互不相溶（或微溶）的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中，經(jīng)過反復多次萃取，將絕大部分的化合物提取出來，是一種較為傳統(tǒng)的方法。例如，用正己烷去除提取液中的脂肪，用三氯乙酸沉淀提取液中的蛋白質(zhì)等。Cai Zengxuan等[14]采用液液萃取結(jié)合UPLC-MS技術(shù)對肉中24種磺胺類藥物進行檢測，樣品采用乙腈提取，乙酸乙酯萃取，結(jié)果顯示，24種磺胺類藥物在15min被完全分離，質(zhì)量濃度在0.2～50μg/kg的范圍內(nèi)，線性指數(shù)為0.991～0.999，回收率為67.8%～113.9%。但液液萃取法有機試劑用量較多，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，應用范圍越來越小。

1.2.2 固相萃取法 固相萃取法（SolidPhase Extraction，SPE），與液液萃取相比，所需樣品體積小，溶劑用量少，回收率相對較高，不易發(fā)生乳化。根據(jù)樣品性質(zhì)的不同，常采用不同的萃取柱進行凈化，一般常用的SPE柱有HLB柱、C18柱、堿性氧化鋁柱及各種陽離子柱等。李俊鎖等[5]采用堿性氧化鋁SPE用于肝組織中7種磺胺藥物的凈化，凈化效果顯著，回收率為68.8%～100.0%，檢出限低于0.05mg/kg。林海丹等[11]采用固相萃取與高效液相色譜結(jié)合的方式，建立了動物源性食品中四種磺胺類藥物的分析方法，動物組織用二氯甲烷勻質(zhì)提取，回收率達到70%以上。劉莉治等[6]建立了超高效液相色譜測定雞蛋中11種磺胺類藥物殘留的分析方法，樣品采用氨化乙腈超聲提取兩次，Waters Oasis HLB固相萃取柱進行凈化，回收率達到80.3%～96.2%。

1.2.3 固相微萃取 固相微萃?。⊿olid Phase Micro-Extration，SPME），可以直接從樣品中富集目標化合物，具有簡單、快速、高效的特點，易與LC聯(lián)用。Lu KuanHui等[15]建立了SPME結(jié)合LC-MS技術(shù)對肉中的8種磺胺類物質(zhì)痕量測定的方法，實驗采用乙腈-水作為提取溶液，比較了不同型號的固相微萃取纖維（100μm PDMS、60μm PDMS/DVB與65μm PDMS/DVB）對磺胺類藥物回收率的影響效果。結(jié)果表明，65μm PDMS/DVB的回收率最好，60μm PDMS/DVB的次之，100μm的單一PDMS固相微萃取纖維最差。另外，實驗進一步考查了萃取溫度與pH對磺胺類藥物回收率的影響，結(jié)果表明，溫度在30℃，pH為5時其回收率最高。固相微萃取因其簡單快速和簡化的樣品預處理步驟，縮短了預處理的時間，避免了乳化現(xiàn)象，減少了溶劑的用量，降低了成本。

1.2.4 免疫親和色譜 免疫親和色譜（Immunoaffinity chromatography，IAC），IAC是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結(jié)合反應為原理的色譜技術(shù)。Li等[16]通過合成半抗原，在大兔體內(nèi)取得免疫效果，純化分離抗體后制備成免疫親和色譜柱，利用其對磺胺類藥物的特異性，待測樣品經(jīng)提取后，通過免疫親和色譜法進行樣品的凈化。免疫親和色譜法可有效的富集和凈化目標物質(zhì)，但必須要有大量純化的特異性抗體，并且要保持抗體的活性，因此其發(fā)展受到了一定的限制。

2 動物源性食品中磺胺類藥物殘留檢測方法研究進展

磺胺類藥物由來已久，檢測技術(shù)也有多種方法，如微生物法、免疫法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳法[17-18]及熒光分析法[19-20]、分子排阻色譜[21]等。

2.1 微生物法

微生物法（Microbiological method）檢測的原理是通過藥物抑制微生物的生長，根據(jù)對某種抗生素敏感的微生物，在適當條件下所產(chǎn)生的抑菌圈大小與抗生素濃度呈正相關(guān)而設(shè)計的[22]。

微生物法曾被用于牛奶中磺胺類藥物的篩選，Gaudin等[23]建立了一種篩選牛奶中藥物殘留的微生物方法，并用篩選的菌種對磺胺類藥物進行檢測，可在低于MRL（最高殘留限量）水平檢測某些磺胺類藥物殘留。Hyun-Hee Chung等[24]采用微生物法和高效液相色譜法對比的方式對韓國進口的牛奶和羊奶樣品中的磺胺類藥物和喹諾酮類藥物殘留進行了篩選檢測，結(jié)果表明，采用微生物方法，269種樣品中21種含有磺胺類藥物殘留，用HPLC檢測發(fā)現(xiàn)這21種樣品中三種樣品中含有SMR。

2.2 免疫分析法

免疫分析方法（Immunoassay，IA）是目前微生物篩選過程中較為實用的一種方法，可以實現(xiàn)批量同時篩選，快速篩選的理想方法，逐漸成為一種成熟的獸藥殘留分析方法，其特點是：不需要昂貴復雜的儀器，費用低、速度快和效率高，可以適用于大量樣本的快速分析，靈敏度高，成本低。主要有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法、生物傳感器法與放射性免疫法等。

王莉等[25]建立了酶聯(lián)免疫法檢測動物源性食品中磺胺間二甲氧嘧啶的殘留，實驗結(jié)果表明，磺胺間二甲氧嘧啶在標準曲線在0～8.1μg/L范圍內(nèi)，對牛奶、蜂蜜及雞蛋樣品進行檢測，并計算其回收率均大于76%，該法制定的試劑盒可以滿足我國市場和進出口食品檢測的需要。劉百紅[26]完成了磺胺嘧啶殘留ELISA快速檢測試劑盒的研制，該試劑盒在豬肉、雞肉與雞肝中的定量限為20μg/kg，回收率在70%～110%之間，在雞蛋與牛奶中定量限為5μg/kg，回收率在60%～120%之間。目前，市場上對于磺胺類藥物殘留的商品化快速檢測試劑盒也有應用。

另外，王喜亮等[27]建立了膠體金免疫層析法測定動物源性食品中的磺胺嘧啶殘留，該法制作的膠體金免疫層析試紙，可在15min內(nèi)完成對磺胺嘧啶殘留的半定量檢測，與其他磺胺類藥物無交叉反應。韓靜等[28]建立了磺胺異噁唑（SIz）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺對甲氧嘧啶（SME）、磺胺甲二唑（SMT）、磺胺氯噠嗪（SCPA）五種磺胺類藥物的多殘留免疫交題金試紙條檢測方法，并將其應用于實際樣本中的磺胺類藥物的初步篩選。

2.3 毛細管電泳法

毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE），是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。S.Fuh MingRen等[29]將肉樣用固相萃取柱（SPE）凈化后，采用毛細管電泳對肉制品中8種磺胺類藥物做了定量分析測定，肉樣的加標范圍在50～500μg/kg，回收率在80%～97%，8種磺胺類藥物的檢測限為5～10μg/kg。Cheng YiJie等[30]建立了在線毛細管電色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定肉樣中磺胺類藥物的殘留，該法可以快速檢測磺胺類藥物，其檢出限低于10μg/L。

2.4 液相色譜法

液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），由于其分離效率高，速度快，操作自動化等特點，成為現(xiàn)代分析實驗中較為廣泛的檢測方法，大多數(shù)的化合物均可用HPLC進行分離測定。最常用的檢測方式為紫外檢測器（UVD）、熒光檢測器（FLD）、電化學檢測器（ECD）以及光二極管陣列檢測器（DAD）等。

典型的液相色譜法測定磺胺類藥物殘留的分析方法是歐美官方實驗室[31-32]測定豬腎中磺胺二甲基嘧啶總量的方法，運用該方法的檢測限為0.01mg/kg。Rodrigo H.M.M Granja等[33]采用HPLC-UVD檢測器測定了蜂蜜中磺胺類藥物殘留的含量，蜂蜜樣品用30%氯化鈉溶液和二氯甲烷提取，用SPE（硅酸鎂）凈化后檢測，磺胺噻唑、磺胺甲惡唑和磺胺二甲氧噠嗪的檢測限分別為3、4、5μg/kg，在濃度為100μg/kg時，其回收率分別為61.0%、94.5%和86.0%。Kao等[12]建立了高效液相色譜光敏二極管檢測器檢測測定雞肉與豬肉中八種磺胺類藥物殘留的方法，樣品經(jīng)乙腈抽提、飽和乙腈正己烷濃縮分離蒸干，經(jīng)固相柱凈化，C18液相色譜柱分離，回收率達到71%以上，檢出限為20μg/kg。王建華等[7]報道了液相色譜電化學檢測器（ECD）測定禽肉中多種磺胺藥物殘留分析方法，磺胺類藥物的回收率為75%～82%。高文惠等[34]報道采用液相色譜-熒光檢測法可以同時測定腸衣中八種磺胺類藥物殘留，樣品經(jīng)1%乙酸-乙腈對腸衣進行提取，經(jīng)熒光胺衍生后測定，該方法的最低檢測限為5ng/mL。

W Hela等[13]報道采用HPLC-DAD可以同時測定動物性可食性組織的12種磺胺類藥物，樣品經(jīng)乙腈超聲提取、正己烷除脂、OASIS MCX柱進行凈化后測定，該方法的檢出限為1μg/L。Won SoYoung等[8]利用HPLC-PDA和LC-MS/MS對韓國國內(nèi)和進口的海洋類產(chǎn)品中的14種磺胺類藥物進行了抽樣檢查，檢查結(jié)果表明，所抽的樣品中99%的樣品不含有此類藥物。

2.5 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)法

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）是目前研究磺胺類藥物應用范圍較為寬廣的一種技術(shù)手段，與液相色譜相比具有分離效率高、分析時間短、速度快、準確率高等優(yōu)點。近幾年，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)廣泛應用與磺胺類藥物多殘留的檢測。

Yu Chunhe等[35]采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法（HPLC-ES-MS/MS）對牛奶和奶粉中的磺胺類藥物殘留進行了分析檢測，樣品經(jīng)C18吸附劑提取，最終牛奶中6類磺胺的檢測限范圍是0.9～10.5μg/L，奶粉中的檢測限范圍為2.7～31.5μg/kg，線性相關(guān)系數(shù)達到0.9922以上。倪永付等[36]利用LC-MS測定了羊肉中6種磺胺類藥物殘留，樣品經(jīng)乙腈勻漿提取，正己烷脫脂后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣吹干，流動相溶解并定容，再用正己烷凈化后上機檢測。結(jié)果表明，6種磺胺質(zhì)量濃度在10～100μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998～0.9998，回收率為78%～105%，定量限為10μg/kg?；谶@個方法，倪永付等[37]又測定了牛肉中10種磺胺類藥物的殘留，10種磺胺質(zhì)量濃度在10～200μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9955～0.9997，回收率為70%～95%，定量限為10μg/kg。

劉佳佳等[3]利用高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)，建立了一種在28min內(nèi)快速分離和測定動物源性食品中24種磺胺類藥物殘留的方法，方法的檢出限（LOD）為0.27～7.45μg/kg。佘永新等[9]利用超高壓液相色譜-電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了10min內(nèi)快速分離與測定牛奶中24種磺胺類藥物殘留的分析方法，樣品經(jīng)勻漿、超聲、乙腈重復提取，氮吹濃縮，流動相定容，飽和正己烷脫脂后，進入串聯(lián)質(zhì)譜進行測定，在ESI+和MRM（多反應監(jiān)測）模式下進行樣品分析，該方法檢出限（LOD）為0.04～1.35μg/kg；在1～200μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為61%～117%。李鋒格等[10]建立了一種分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定雞肝中12種磺胺類殘留的分析方法，樣品用酸化乙腈溶液提取后，采用NH2吸附劑凈化，正己烷脫脂測定，正離子電離模式，內(nèi)標法定量，其檢出限為5μg/kg，定量限為10μg/kg，平均回收率為72%以上。

3 展望

隨著現(xiàn)代社會科學技術(shù)的發(fā)展，檢測類儀器不斷更新?；前奉愃幬餁埩魴z測研究重點逐漸發(fā)展為二個方面，一是通過建立快速處理樣品前處理技術(shù)，節(jié)約樣品分析時間和成本；二是提高樣品痕量檢測的靈敏度及建立多殘留同步檢測方法。因此，尋求一種簡便、靈敏度高、快速定性磺胺類藥物多殘留檢測技術(shù)，是食品檢驗工作的重中之重。

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