真菌毒素免疫分析中新型檢測元件的研究進展

賀貞云，何慶華，許 楊

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047)

真菌毒素是由真菌產生的次生代謝產物，主要污染于谷物、飼料以及發(fā)酵食品中，已被證實對人和動物具有多種特定器官的毒性以及致癌性［1］。因此，食品中真菌毒素的監(jiān)控對于保障食品質量安全具有十分重要的意義。檢測真菌毒素的方法眾多［2－4］，其中免疫檢測具有靈敏度高、特異性強、快速方便等優(yōu)點，特別適合于對真菌毒素污染監(jiān)控中大批量樣本的篩檢工作。雖然基于抗體和毒素間特異性結合反應的免疫檢測有諸多優(yōu)點，但是傳統(tǒng)的完整抗體有其特定的限制。以建立雜交瘤細胞株生產的單克隆抗體，需要免疫動物，制備技術復雜，費時費工;雖然特異性極強，但是只能與一種抗原決定簇結合，限制了多種真菌毒素的同時檢測;易變性及水解，不能在苛刻的環(huán)境下使用。基于上述原因，研究人員致力于開發(fā)更為廉價、方便制備，或是在極端條件下仍保持結構穩(wěn)定的檢測元件。這些元件可分為重組類檢測元件、合成類檢測元件和其他元件。重組類檢測元件主要是采用基因工程技術得到的重組抗體片段，包括單鏈抗體、單域抗體、雙特異性抗體等。合成類檢測元件則是利用化學法合成能與真菌毒素特異性結合的非天然材料，如分子印跡聚合物。除了為超越傳統(tǒng)抗體應運而生的新型檢測元件之外，還有一些在免疫分析過程中替代真菌毒素本身的檢測元件，如抗原模擬表位和抗獨特型抗體。本文綜述了在真菌毒素免疫分析中有潛在應用價值的檢測元件，并對其未來發(fā)展方向加以預測。

1 重組類檢測元件

抗體可變區(qū)中的六個高變區(qū)決定了抗體與抗原結合的特異性和親和力［5］。因此人們通過還原、水解、基因重組等方法分離抗體的可變區(qū)，以減小抗體的分子量并保留與其抗原結合的特性。由于重組抗體的生產技術日漸成熟，而且這些重組分子在檢測方法中的識別程度越來越高，重組抗體已廣泛應用于真菌毒素的免疫檢測［6］?？拐婢舅氐闹亟M抗體主要有單鏈抗體、單域抗體和雙特異性抗體等。

1.1 單鏈抗體

單鏈抗體是利用基因工程原理將天然抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一條連接肽(linker)連接形成的單鏈分子。單鏈抗體特異性高，抗原性低，利于在組織中滲透和擴散、易于基因操作和基因工程大量生產，拓寬了真菌毒素等小分子抗體的應用范圍。起初，獲得單鏈抗體的方法主要有兩種:一是從雜交瘤細胞擴增抗體的VH和VL，二是從免疫動物的白細胞或脾臟內提取RNA，經反轉錄后再進行擴增［7］。但兩種方法都需要免疫動物，重復了單克隆抗體的制備過程。2005年，Lauer［8］等人通過淘選天然單鏈抗體噬菌體庫獲得抗伏馬菌素B1單鏈抗體，因而無需免疫動物。單鏈抗體與完整抗體相比缺少恒定區(qū)，在結構上的差異使得其與真菌毒素結合的親和力較親本單克隆抗體相比較弱。Choi［9］等將抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的單鏈抗體編碼基因轉入大腸桿菌表達系統(tǒng)，使其與6個組氨酸殘基融合表達，表達產物經純化后測得具有結合抗原的生物學活性，但是親和力不如抗DON單克隆抗體。Min［10］等表達的抗伏馬菌素B1(FMB1)單鏈抗體親和力較單克隆抗體低12倍。由于此種單鏈抗體沒有經歷體內的親和成熟過程［11］，一般重組的單鏈抗體親和力比單克隆抗體低，在一定程度上限制了單鏈抗體在食品檢測中的應用。因此，為提高單鏈抗體的親和力找到一種行之有效的方法是目前亟待解決的問題。Zahnd［12］等采用體外定向進化技術對單鏈抗體進行改造，結果顯示其親和力提高了8倍。Chang［13］等人成功地在畢赤酵母中表達抗玉米赤霉烯酮(ZEN)單鏈抗體，經表面等離子共振技術分析其結合能力，結果顯示，原始單鏈抗體與抗ZEN單克隆抗體的親和力相當，經密碼子優(yōu)化后的單鏈抗體親和力略有提高。單鏈抗體在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，產物的溶解性、結合活性和產量都有一定提高。

單鏈抗體具有分子量低、特異性高、抗原性低、易表達等優(yōu)點，但其親和力低，而且表達產物易形成無活性的包涵體［14］。將單鏈抗體與分子伴侶和折疊酶共表達［15］，或者采用優(yōu)化表達條件［16－17］，基因突變［6］等方法可以提高表達產物的可溶性及親和力。

1.2 單域抗體

繼單鏈抗體之后又出現了分子量更低的單域抗體(Single－Domain Antibody)。單域抗體又稱納米抗體，由重鏈抗體的可變區(qū)構成，是來自于駱駝、鯊魚等動物中天然缺失輕鏈的抗體。單域重鏈抗體分子量約15ku，具有易表達、高水溶性、耐高溫、耐極度pH等優(yōu)點，目前已廣泛用于基礎研究、醫(yī)學診斷和檢測、抗體藥物開發(fā)等領域［18］。雖然單域抗體較單鏈抗體的分子量更低、保守區(qū)更少，但卻顯示出更高的特異性。Doylea P J［19］等建立了抗 15－乙?；璂ON(15－AcDON)單域抗體的噬菌體庫，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對淘選得到的陽性克隆NAT－267進行表達，獲得了蛋白mNAT－267單體和 pNAT－267五聚體。二者都能特異地與15－AcDON結合，IC50分別為1.24μmol/L和0.50μmol/L，且前者與免疫美洲駝(Llama glama)56天后血清的特異性(IC50為1.42μmol/L)相當。Van Houwelingen［20］等人通過免疫羊駝獲得多個抗赭曲霉毒素A(OTA)的單域抗體片段，并用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達出具有較高親和力及特異性的重組單域抗體。其中單域抗體OCH－62分別與赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B結合的IC50為12和476ng/mL，與其他食品中常見的OTA結構類似物，如苯丙氨酸和香豆素無明顯交叉反應，可以代替單克隆抗體應用于食品中OTA的免疫檢測。單域抗體在真菌毒素免疫檢測中的應用逐漸進入國內研究領域。2010年，涂追［21］成功構建了天然噬菌體單域重鏈抗體文庫，并以DON－MBSA人工抗原為配基，經淘選得到一種可以與DON－MBSA特異性結合的單域抗體。單域抗體作為最新發(fā)展起來的小分子抗體以其分子小、溶解度高、熱穩(wěn)定性好、可以重新折疊［22］等優(yōu)點，克服了單鏈抗體在原核表達系統(tǒng)中容易形成包涵體的缺憾，隨著人們對其研究的深入，單域抗體將在真菌毒素免疫檢測中得以廣泛應用。

1.3 雙特異性抗體

雙特異抗體(Bispecific Antibody，BsAb)最早出現于上世紀80年代，主要是采用化學偶聯(lián)方法制備的鼠源性F(ab’)2以及(IgG)2;到了90年代初，出現了雙雜交瘤融合而成的雜交－雜交瘤。目前應用最多的是利用基因重組技術制備的雙特異基因工程抗體。雙特異性抗體是一類具有雙功能的雜交分子，二價抗體中的Fab片段具有不同特異性，能與不同的配體結合。雙特異性抗體最初應用于腫瘤的臨床治療，因其具有兩個抗原結合位點，其中一個與靶抗原結合，另一個與效應細胞結合，因而引導效應細胞靶向殺滅腫瘤細胞［23］。如果將兩種或兩種以上抗真菌毒素抗體的基因整合在一個重組抗體上，就可以制備同時檢測兩種或兩種以上真菌毒素的抗體分子，在真菌毒素檢測中具有良好的應用前景。例如，2008年 Wang［24］等構建了一種抗DON和抗 ZEN的雙特異性單鏈抗體，經鑒定其保留了單鏈抗體對DON和ZEN的親和力。目前，將雙特異性抗體應用于真菌毒素檢測的研究還非常少，主要原因有單鏈抗體的溶解度和穩(wěn)定性較低［25］，表達蛋白易形成包涵體，連接兩個單鏈抗體片段的linker最佳長度和氨基酸序列還需進行優(yōu)化［26］。因此對于含兩種以上抗原結合位點的多特異性抗體還有待進一步研究。

2 合成類檢測元件

設計并合成能夠結合真菌毒素的多聚體在真菌毒素檢測領域是一個新技術，其中最具代表性的就是分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，簡稱MIP)。分子印跡聚合物是利用分子印跡技術制備的具有與模板分子在空間結構和結合位點上完全匹配的高分子聚合物。1973年Wulff［27］研究小組首次成功制備出MIP，使分子印跡技術產生了突破性進展。Pascale［28］等用衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸鹽為交聯(lián)劑，1－偶氮－雙－(環(huán)己雙－1－甲腈)為引發(fā)劑，DON為模板，合成了DON分子印跡聚合物。Turner［29］等用非共價鍵法合成能與赭曲霉毒素A特異性結合的MIP，并且其親和力和選擇性都較好，他們認為緩沖液的濃度、pH、有機溶劑等因素對MIP的識別作用有重要的影響。盡管MIP作為真菌毒素檢測元件的親和力和選擇性都不如相對應的抗體，但因其自身耐受性強、容易制備、能反復使用等優(yōu)點，在真菌毒素的固相萃取方面已有廣泛研究［30－32］。MIP在仿生傳感器的研制方面取得了一定進展，其重要應用是取代生物分子作為識別元件，通過待測分子與識別元件的結合，對待測分子實時測定［33］。Yaqub［34］等利用原位聚合法在壓電轉換器的金電極上合成MIP，作為一種新型人工受體識別阿特拉津(Atrazine)，制成可用于檢測農藥阿特拉津的化學傳感器(“塑料抗體”)，其檢測限為20ppb，檢測范圍較寬，線性較好。但是與其他MIP一樣，阿特拉津MIP傳感器同樣能與其代謝產物和結構類似物結合，交叉反應率高，降低了分子識別的選擇性。如果將MIP仿生傳感器應用于真菌毒素的檢測，對于同時檢測多種真菌毒素及其代謝產物(如黃曲霉毒素B1、B2、M1、M2)具有重要意義。然而，目前還沒有將MIP應用于真菌毒素檢測的商業(yè)化產品。原因之一是免疫親和萃取技術對于分子印跡技術而言是強有力的競爭對手，而且在市場上占有率居高。另外一個原因則是真菌毒素的高毒性和高價格使得MIP的制備過程極其危險，且成本偏高［35］。

3 其他檢測元件

真菌毒素不僅對人及動物具有多種特定器官的毒性以及致癌性［36］，而且價格昂貴。因此，人們試圖找到一種可以代替真菌毒素標準品的檢測元件。目前針對真菌毒素半抗原的研究包括抗原模擬表位和抗獨特型抗體。

3.1 抗原模擬表位

噬菌體展示技術是一種將基因表達產物與親和淘選相結合的技術，它以改造的噬菌體為載體，將待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質的編碼基因，使其基因表達產物在噬菌體表面展示，進而通過親和富集淘選展示特異肽或蛋白質的噬菌體。Thirumala－Devi［37］等從噬菌體展示隨機肽庫中淘選與抗黃曲霉毒素單克隆抗體MAb 24和MAb 13結合的噬菌體，將其應用于競爭ELISA檢測黃曲霉毒素。結果表明噬菌體展示模擬表位可以有效代替純毒素用于安全、廉價ELISA檢測模式。Lai［38］等將噬菌體展示的OTA模擬表位應用于膠體金試紙條檢測技術，可以在10min內檢測10ppb OTA標準品，為建立一種安全且快速的真菌毒素檢測方法提供了堅實基礎。模擬表位有望在免疫學研究中成為天然真菌毒素的替代品，解決毒素標準品來源受限的問題，并且對建立真菌毒素的無毒檢測體系意義重大。各種真菌毒素，如 DON［39］、OTA［40］、ZEN［41］等，模擬表位已通過淘選噬菌體展示肽庫得到驗證，然而其氨基酸序列并無顯著同源性，這為真菌毒素模擬表位基序的進一步研究帶來了困難。此外，展示在噬菌體表面的多肽因噬菌體自身生物活性的影響，其穩(wěn)定性受到一定限制。因此噬菌體展示模擬表位在進入應用階段之前，還存在一些尚待解決的問題。

3.2 抗獨特型抗體

抗獨特型抗體是針對抗體可變區(qū)的抗原決定簇(獨特型)產生的特異性抗體。抗獨特型抗體在機體內形成，當機體接受外來抗原刺激時，能識別外來抗原的淋巴細胞克隆首先被激活，產生針對外來抗原的抗體(Ab1)，隨后能識別某一個克隆獨特型決定簇的第2個克隆被激活，產生抗獨特型抗體(Ab2)，依次類推還可以有第3個(Ab3)，第4個(Ab4)……這些克隆相互制約，相互連鎖，形成一個閉合型、多層次級聯(lián)網絡［42］?？躬毺匦涂贵w應用于真菌毒素檢測具有以下優(yōu)點:實現相似結構靶標物的多殘留檢測;提高小分子免疫分析的靈敏度;生產無毒試劑盒［43］。Chu［44］等用單克隆抗體免疫新西蘭白兔，得到針對伏馬菌素B1(FMB1)的抗獨特型抗體(Ab2)。通過鑒定Ab2的生物學活性，發(fā)現Ab2可作為FMB1及其他毒素檢測分析的新一代抗原。因此抗獨特型抗體可以替代毒素標準品在免疫檢測中使用，避免了劇毒物質對檢測人員的健康威脅，而且省去了將毒素半抗原與大分子蛋白質偶聯(lián)這一步驟即可作為安全有效的免疫抗原。此外，針對其他真菌毒素如T－2毒素［45］、黃曲霉毒素［46］等無毒檢測方法已建立。但是，抗獨特型抗體并沒有真正在真菌毒素免疫檢測中得以應用。其主要原因是抗獨特型抗體制備難度大，首先必須得到單克隆抗體，再經免疫之后篩選可以用于建立檢測技術所需的抗獨特型抗體難度較高，其成本甚至高于毒素標準品。最新研究成果表明，能否獲得具有模擬抗原特性的抗獨特型抗體，免疫原為關鍵所在。2011年，林超［47］等利用酶切純化的F(ab’)2片段作為免疫原制備抗大田軟海綿酸單抗獨特型抗體，消除針對Fc片段的抗體，獲得更好的免疫效果。如果將抗獨特型抗體與基因重組抗體技術相結合，建立基于某種真菌毒素的抗獨特型抗體庫，便可以大大提高抗獨特型抗體的篩選效率，并且能夠有效地降低生產成本，為其在食品安全檢測領域的應用提供技術支持。

4 小結

越來越多的新型檢測元件已應用于真菌毒素檢測體系，他們有各自的優(yōu)缺點。單鏈抗體和單域抗體利用其分子量低、特異性高、抗原性低、易表達、利于在組織中滲透和擴散等優(yōu)勢，在新型抗體的研究領域發(fā)展迅速。但是大多數單鏈抗體的親和力不如單克隆抗體，而且表達產物易形成無活性的包涵體。將單鏈抗體與分子伴侶和折疊酶共表達，或者采用優(yōu)化表達條件，更換表達載體或表達系統(tǒng)等方法可以提高表達產物的可溶性。單域抗體就沒有這一限制，即使表達出包涵體也容易復性。此外利用體外定向進化、基因突變等分子改造技術提高重組抗體的親和力被證實是可行的。雙特異性抗體因其具有多價抗體的性質可實現多種真菌毒素的同時檢測，有其獨特的應用價值，但是有關報道很少，相關技術還有待更深入地研究。相較于重組類抗體，分子印跡聚合物以其較高的耐受性、制備方法簡便、能重復使用等特點受到越來越多的關注。然而由于真菌毒素價格高、毒性強，制備相應的分子印跡聚合物不僅成本高而且存在危險。如果將分子印跡技術與抗體技術結合，即可制備一種超越MIP的新型材料，使其既能用化學方法合成、可以反復使用、穩(wěn)定性高，又具有與抗體相似的親和力及特異性。還有一些檢測元件旨在代替價格高昂、且危害檢測人員身體健康的真菌毒素標準品。已有不少研究證明噬菌體展示模擬表位可以代替真菌毒素建立無毒ELISA檢測體系。但必須指出，噬菌體展示肽不穩(wěn)定、易降解的缺點不可避免地限制了其作為檢測元件的應用范圍。早在上世紀90年代已有人指出基于真菌毒素的抗獨特型抗體可以替代毒素標準品在免疫檢測中使用，但其制備難度大、成本高，不能大規(guī)模投入生產。將抗獨特型抗體與基因重組抗體技術相結合有望在未來解決這一難題。

不論任何一種新型檢測材料，除了具備免疫檢測元件所必須的敏感性和特異性等基本條件以外，還應該具有比傳統(tǒng)元件更優(yōu)越的性能。目前人們所發(fā)現的新型檢測材料仍處于探索階段，還有待更多實驗的考證。隨著技術的進步，筆者相信在不久的將來，會有更多的新型檢測元件在真菌毒素免疫分析中廣泛使用。

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