加工肉制品中雜環(huán)胺的檢測方法及抑制措施的研究進展

秦 川，鄭宗平，曾茂茂，何志勇，陳 潔

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines，HAAs)是肉類等富含蛋白質的食物在烹調過程中經(jīng)過一系列的化學反應產(chǎn)生的致癌、致突變的化合物［1］。1977年，日本科學家在烤焦的牛肉、魚的表面發(fā)現(xiàn)潛在致突變物質［2］。此后，人們對于此類烹調產(chǎn)生的致癌物質的研究逐漸深入，此類致癌物質即為雜環(huán)胺。雜環(huán)胺屬多環(huán)芳烴類化合物，對于富含蛋白質的食物，300℃的加熱溫度是產(chǎn)生不同種類雜環(huán)胺的分界限，當溫度大于300℃時，蛋白質受熱分解產(chǎn)生的雜環(huán)胺為氨基咔啉類(amino-carbolines)［3］;溫度小于 300℃時產(chǎn)生的雜環(huán)胺為氨基咪唑氮雜芳烴類(aminoimidazole-azaarenes，AIAs)。氨基咔啉類雜環(huán)胺可分為α-咔啉類，β-咔啉類，γ-咔啉類和δ-咔啉類;而AIAS類雜環(huán)胺則可分為喹啉類(quinoline)，喹喔啉類(quinoxaline)和吡啶類(pyridine)。按極性劃分，雜環(huán)胺可分為極性雜環(huán)胺和非極性雜環(huán)胺。目前發(fā)現(xiàn)的雜環(huán)胺超過25種，其縮寫分別為:DMIP、1，5，6-TMIP、3，5，6-TMIP、PhIP、4′-OH-PhIP、IFP、iso-IQ、IQ、MeIQ、IQ、MeIQ、IQ［4，5-b］、4-MeIQx、8-MeIQx、7，8-DiMeIQx、4，8-DiMeIQx、4-CH2OH-8-MeIQx、TriMeIQx、IgQx、7-MeIgQx、6，7-DiMeIgQx、7，9-DiMeIgQx、Phe-P-1、AαC、MeAαC、Harman、Norharman、Trp-P-2、Trp-P-1、Glu-P-2、Glu-P-1、Orn-P-1、Cre-P-1、Lys-P-1。肉制品中的雜環(huán)胺含量因肉的種類，肉的加工、烹調方式的不同存在較大差異，但總體上處于ng級別。鑒于肉制品中的雜環(huán)胺含量極低，且易受到共提物的影響，行之有效的檢測方法顯得尤為關鍵，高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質譜法成為近些年雜環(huán)胺檢測的主流方法。與此同時，隨著公眾對健康飲食需求的日益提高，如何對肉制品中致癌、致突變的雜環(huán)胺進行有效抑制也成為當前的一個研究熱點。本文概述了近二十年來肉制品中雜環(huán)胺的提取方法、檢測技術及抑制措施。

1 肉制品中雜環(huán)胺的提取及檢測方法

雜環(huán)胺僅以痕量水平(ng/g)存在于肉制品中，因此合理、高效的提取和檢測方法對于雜環(huán)胺的分析和研究至關重要。

1.1 肉制品中雜環(huán)胺的提取方法

肉制品中雜環(huán)胺的提取，第一步包含一個溶解的過程，采用不同的溶劑均質樣品。溶劑分為有機溶劑和無機溶劑兩大類:有機溶劑包括丙酮、乙酸乙酯、甲醇等;無機溶劑包括水、鹽酸、氫氧化鈉等。第二步通常為用離心或過濾的方式除去肉制品中的蛋白質等雜質。而除雜最常用的技術為液液萃取，如果均質溶劑為有機溶劑，那么萃取溶劑通常采用鹽酸;如果均質溶劑為無機溶劑，那么萃取溶劑通常采用有機溶劑，如二氯甲烷［4-5］、乙酸乙酯［6-7］。而液液萃取通常與吸附劑萃取相結合。吸附劑通常采用硅藻土［4］，也有報道采用藍色人造纖維［8］。在對雜環(huán)胺進行初步的前處理后，由 G A Gross［4］等提出的固相萃取法成為對雜環(huán)胺進行進一步分離和純化的常規(guī)方法，包括陽離子交換固相萃取和反相固相萃取。陽離子交換固相萃取的原理是化合物上與硅膠鍵合相的帶電基團之間的相互吸引，而反相固相萃取的原理是分析物的碳氫鍵與硅膠表面官能團的吸附作用。如G A Gross［4］等使用丙基磺酸柱(PRS)和反相C18柱進行固相萃取;而 C Messner［7］等則使用 MCX 混合陽離子交換萃取柱進行固相萃取。固相萃取的步驟一般包括柱子的活化、減壓干燥、上樣、清洗和洗脫。固相萃取后，對樣品進行濃縮，通常使用氮氣吹干后再用甲醇溶解檢測。

1.2 肉制品中雜環(huán)胺的檢測方法

肉制品中雜環(huán)胺的檢測方法包括氣相色譜法(GC)，氣相色譜串聯(lián)質譜法(GC-MS)，高效液相色譜—紫外檢測法(HPLC-UV)，高效液相色譜—熒光檢測法(HPLC-FD)，高效液相色譜—電化學檢測法(HPLC-ECD)，高效液相色譜串聯(lián)二級質譜法(HPLC-MS-MS)，超高效液相色譜串聯(lián)二級質譜法(UPLC-MS-MS)等。

1.2.1 氣相色譜法(GC) 絕大多數(shù)雜環(huán)胺都不易揮發(fā)且具有一定的極性，而且由于其對色譜柱的強吸附性易造成峰的拖尾，在較低濃度時雜環(huán)胺不易被檢出。因此，氣相色譜檢測之前通常要進行衍生化處理。雜環(huán)胺經(jīng)衍生化處理后，不僅極性降低，而且揮發(fā)性、靈敏度、分離度也有較大提高［9］。

因為雜環(huán)胺中存在氮原子，氣相色譜法檢測雜環(huán)胺通常采用氮磷檢測器(NPD)。H Kataoka［10］等人通過一種簡單、快速的衍生化方法，可以用氮磷檢測器檢測出10種雜環(huán)胺。但是AαC和Glu-P-2兩種雜環(huán)胺的色譜圖重疊在一起無法分開。

氣相色譜技術雖然具有較高的分離性能，但只有少數(shù)雜環(huán)胺能經(jīng)衍生化處理，且當樣品中雜環(huán)胺濃度太低時，也存在著定量不準確的缺陷，因此氣相色譜技術在雜環(huán)胺檢測領域應用較少。

1.2.2 氣相色譜法串聯(lián)質譜法(GC-MS) 由于結合了氣相色譜儀的高分離性能和質譜儀的高選擇性和靈敏度，氣相色譜串聯(lián)質譜(GC-MS)是最好的在線檢測方法之一［9］。有些報道［10-11］已經(jīng)證實雜環(huán)胺可以用GC-MS進行檢測，但是也僅限于少數(shù)能經(jīng)衍生化處理的雜環(huán)胺檢測。L Warzecha［12］等用五氟丙酸酐(PFPA)對雜環(huán)胺進行衍生;S Casal［13］等用添加1%叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMCS)的三氟乙酰胺(MTBSTFA)對雜環(huán)胺進行衍生。另外，也有使用乙酸、三氟醋酸等衍生化試劑。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC) 所有的雜環(huán)胺都具有紫外吸收波長，且其具有一定的極性、不易揮發(fā)的特點，以及高效液相色譜—紫外檢測法(HPLCUV)操作相對簡便，不需要像氣相色譜法那樣進行衍生化處理，使其成為過去數(shù)十年來用于雜環(huán)胺檢測的常規(guī)方法。對于有些能產(chǎn)生熒光信號的雜環(huán)胺，也可以通過熒光檢測器(FD)來進行檢測。然而通常情況下，熒光檢測器(FD)作為紫外檢測器(UV)或二極管陣列檢測器(DAD)的補充以排除雜質峰的干擾和更好的定量。高效液相色譜法的流動相一般采用p H3.2～3.6的三乙胺磷酸緩沖液和乙腈。高效液相色譜法雖然是雜環(huán)胺研究最普遍的方法，最高可同時檢測出十幾種雜環(huán)胺，但也存在著靈敏度低，定量不準確的缺陷。

應用于高效液相色譜法測定雜環(huán)胺的反相色譜柱也是多種多樣，其中TSK gel ODS柱因峰型好，分離度高的特點而應用最為廣泛［4，14-18］。G A Gross［4］等采用三元流動相同時分離出12種致突變型雜環(huán)胺和2種非致突變型雜環(huán)胺harman和norharman。K Puangsombat［17］等用 0.01mol/L 的三乙胺磷酸緩沖液和乙腈進行二元梯度洗脫，對熱狗等市售方便肉制品進行雜環(huán)胺的含量測定，檢測出5種雜環(huán)胺:IQ、IQx、MeIQx、DiMeIQx、PhIP。而除了 TSK gel ODS 型色譜柱外，也有許多報道采用其它的色譜柱，如K W Cheng［19］等使用 YMC型 C18色譜柱研究水果提取物對雜環(huán)胺的抑制作用，檢測3種雜環(huán)胺(PhIP、4，8-DiMeIQx、MeIQx)含量的變化。

1.2.4 液相色譜串聯(lián)質譜法(LC-MS)LC-MS很好地結合了色譜良好的分離能力和質譜的高靈敏度和高選擇性，并且通過高效液相色譜串聯(lián)二級質譜(LC-MS-MS)可以達到更佳的選擇性［20］。目前有3種離子化技術應用于LC-MS中:熱噴霧(TSI)技術、電噴霧(ESI)技術和大氣壓化學電離(APCI)技術，而 ESI和 APCI的靈敏度較 TSI更高。J Lee［21］等研究壓橄欖油對烤牛肉中雜環(huán)胺含量的影響，使用LC-MS檢測雜環(huán)胺含量變化，采用串聯(lián)單一四級桿檢測器(MSD)，流動相為30mmol甲酸銨緩沖液和乙腈，色譜柱為RX-C8型，可同時測定15種雜環(huán)胺含量，回收率在35%～70%之間。

近些年來，超高效液相色譜(UPLC)技術迅速發(fā)展，超高效液相色譜串聯(lián)二級質譜(UPLC-MS-MS)廣泛應用于雜環(huán)胺含量測定［20］，具有分離度高，分析快速的優(yōu)點。呂美［22］等使用超高液相色譜—電噴霧串聯(lián)二級質譜(UPLC-ESI-MS-MS)檢測添加香辛料的牛肉中三種雜環(huán)胺(AαC、Norharman、PhIP)的含量變化，采用乙酸銨和乙腈作為流動相，具有較好的定量效果。E Barceló -Barrachina［23］等使用 UPLCESI-MS-MS對凍干肉制品中的雜環(huán)胺進行快速檢測，可以在2min內完成對16種雜環(huán)胺的檢測分析。

2 肉制品中雜環(huán)胺的抑制措施

雜環(huán)胺具有潛在的強致癌和致突變作用，并在動物實驗中已證實具有致癌和致突變作用，對人體健康也有可能帶來危害，因此如何抑制肉制品中雜環(huán)胺的產(chǎn)生是當前的一個研究熱點。目前的研究主要集中在采取合理的烹調方式，降低烹調溫度和時間，添加香辛料，添加人工或合成的抗氧化劑和添加植物提取物等方面。

2.1 合理的烹調方式

近些年，許多研究表明，烹調方式對肉制品中雜環(huán)胺的種類、含量有很大的影響［24-27］。F Oz［24］等考察了不同烹調方法對雞肉和魚肉體系中雜環(huán)胺產(chǎn)生量的影響，分別采取微波加熱、烤箱、電爐、平底鍋煎炸和燒烤的方法。結果表明，微波加熱產(chǎn)生的雜環(huán)胺最多，其次為平底鍋煎炸和燒烤，而使用烤箱和電爐則產(chǎn)生較少的雜環(huán)胺。G Z Liao［25］等分別使用碳烤 (20min，200℃)、烤 箱 (20min，200℃)、油 炸(10min，180℃)、平底鍋煎炸(5min 每面，180℃)的方法烹調雞脯肉和鴨脯肉。結果表明，碳烤的雞脯肉中雜環(huán)胺含量最高，達到112ng/g，總體而言，碳烤和平底鍋煎炸產(chǎn)生的雜環(huán)胺相對較多。產(chǎn)生雜環(huán)胺含量過高可能的原因是:肉類與受熱平面直接接觸，如平底鍋煎炸;溫度過高，如燒烤［26］;水分流失，導致一個相對干燥的平面，而其附近的溫度更高，且形成的雜環(huán)胺的前體物質富集，進而通過一系列反應生成雜環(huán)胺［27］。因此，采取合理的烹調方式，避免過高的溫度、直接與高溫熱源接觸和水分流失就能有效抑制雜環(huán)胺的產(chǎn)生。

2.2 降低烹調溫度和時間

研究表明，烹調溫度和時間對雜環(huán)胺的產(chǎn)生量也有巨大的影響［28-30］。M Bordas［28］等人在凍干肉類提取物和液態(tài)肉類提取物的模擬體系中對分別對溫度和時間對雜環(huán)胺的影響進行了考察，結果表明，較高的溫度和較長的烹調時間能夠使雜環(huán)胺的含量大幅上升。B G Abdulkarim［29］等人對火腿、香腸、臘腸進行了研究，發(fā)現(xiàn)85℃沒有促進雜環(huán)胺的生成，190～230℃雜環(huán)胺含量提高 2～5 倍。P Arvidsson［30］等人在肉汁體系中對 IQx，PhIP，MeIQx，7，8-DiMeIQx，4，8-DiMeIQx等多種雜環(huán)胺含量在不同溫度和時間下進行了測定。結果表明125℃，加熱45min，可以檢測到IQx;而當溫度上升到125～150℃后，多種雜環(huán)胺含量急劇上升;隨著時間的延長，雜環(huán)胺含量繼續(xù)上升，并逐漸趨于平緩。

2.3 添加香辛料

研究［22，31-35］表明，肉制品中添加香辛料可以顯著影響雜環(huán)胺的生成。J Dama?ius［31］等在牛肉中加入羅勒、牛至等香辛料，結果表明，添加羅勒、牛至均導致PhIP的含量升高;而添加羅勒可以降低Trp-p-1的含量，添加牛至卻導致Trp-p-1含量的上升;同時添加羅勒和牛至可以降低 Tro-p-2的含量。Z Balogh［32］等在牛肉中加入迷迭香，可以降低PhIP含量。E Persson［33］將迷迭香加入壓榨橄欖油中，可以降低牛肉漢堡中HAs含量。F Oz［34］等在高脂肪的肉球中加入黑胡椒，發(fā)現(xiàn)225℃的煎炸溫度下未添加黑胡椒的肉球產(chǎn)生的PhIP含量高達37.81ng/g;而添加黑胡椒的肉球則未檢測出PhIP。黑胡椒對PhIP的抑制效果達100%。K Puangsombat［35］等考察了幾種亞洲產(chǎn)香料對煎牛肉中雜環(huán)胺的抑制，發(fā)現(xiàn)姜黃可以使雜環(huán)胺總量降低39.2%，提琴形凹唇姜使雜環(huán)胺總量降低33.5%，而高良姜使雜環(huán)胺總量降低18.4%。呂美［22］等對中國傳統(tǒng)香辛料(高良姜、麻椒、花椒等)對煎炸牛肉餅中雜環(huán)胺形成的影響進行了研究，結果表明，高良姜的抑制效果最好，對PhIP的抑制率為100%，且對AαC和Norharman也有較好的抑制作用，抑制率分別為77.27%和77.08%，對煎烤牛肉中雜環(huán)胺總量的抑制達到了78.32%。作者進而對6種香辛料清除ABTS自由基的能力和其抑制雜環(huán)胺的能力進行線性相關分析，發(fā)現(xiàn)不具有相關性，而這與 J Dama?ius［31］的結論一致，說明香辛料的抗氧化性并不是其對雜環(huán)胺存在抑制作用的原因。

2.4 添加天然或人工合成的抗氧化劑

天然抗氧化劑，如維生素、類胡蘿卜素、黃酮類化合物等，許多報道表明其對加工肉制品中雜環(huán)胺的產(chǎn)生具有明顯的抑制效果。D Wong［36］等考察了11 種水溶性維生素(VB1、VB2、VB3、VB5、PM、PN、PL、VB7、VB9、VC、VB12)對模擬體系和煎炸牛肉中兩種雜環(huán)胺(PhIP、MeIQx)含量變化的影響，結果表明6 種維生素(VB2、VB3、VB5、PL、VB9、VB12)對雜環(huán)胺的抑制作用超過40%。K W Cheng［37］等考察了12種酚類化合物對模擬體系和牛肉中雜環(huán)胺含量變化的影響，結果表明:柚皮苷、槲皮素等黃酮類化合物均能抑制PhIP的產(chǎn)生;而迷迭香酸、鼠尾草酸等酚酸類化合物則促進了PhIP的產(chǎn)生。進一步研究表明［38-39］，柚皮素(naringenin)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)均可與雜環(huán)胺生成的中間產(chǎn)物苯乙醛結合，生成特定的化合物，從而間接抑制了雜環(huán)胺PhIP的生成。

而添加人工合成的抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等也對雜環(huán)胺的生成有較大影響。C M Lan［40］等研究表明，BHT對雜環(huán)胺有輕微的抑制作用。但人工合成的抗氧化劑是否對人體存在潛在的危害，尚存在爭議。

2.5 添加植物提取物

目前，大量研究［19，41-44］表明植物提取物對雜環(huán)胺也具有明顯的抑制作用。K W Cheng［19］等研究4種植物提取物(蘋果、接骨木、葡萄、菠蘿)對三種雜環(huán)胺(PhIP、4，8-DiMeIQx、MeIQx)的抑制作用，結果表明:接骨木和菠蘿的提取物具有輕微的抑制作用，而蘋果和葡萄的提取物則有較強的抑制作用(約為70%)。M Gibis［41］等在腌泡汁中分別加入大蒜、洋蔥、檸檬來研究其對煎炸牛肉中雜環(huán)胺的抑制作用，發(fā)現(xiàn)三者最佳的抑制效果分別為31.2%，28.6%，14.6%。J Lee［21］等考察了初壓橄欖油(EVOO)對烤牛肉中15種雜環(huán)胺的抑制作用，結果表明，當EVOO添加量在2～4g范圍內時對雜環(huán)胺有較強的抑制作用，而添加額外的EVOO則促進了某些雜環(huán)胺的生成。I Quelhas［42］等研究了綠茶對四種雜環(huán)胺(PhIP、AαC、4，8-DiMeIQx、MeIQx)的抑制作用，將牛肉事先用綠茶浸泡數(shù)小時進而煎炸。結果表明綠茶對PhIP和AαC兩種雜環(huán)胺有較為明顯的抑制作用，且隨著浸泡時間的變化，雜環(huán)胺含量也有較大差異，而4，8-DiMeIQx和MeIQx兩種雜環(huán)胺的含量則沒有明顯的變化。

3 結語

近些年，隨著人們對于飲食健康要求的日益增大，肉制品中雜環(huán)胺的研究也日益深入，而雜環(huán)胺的檢測技術也逐漸提高，UPLC-MS-MS等先進的分析技術越來越多的應用于雜環(huán)胺的檢測中。與此同時，雜環(huán)胺抑制作用機理的研究也在逐漸發(fā)展和深入。相信在不久的將來，一定能夠找到簡單、經(jīng)濟、實用的抑制雜環(huán)胺的措施，并且建立一個完善的加工肉制品中雜環(huán)胺的檢測標準。

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