• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇不是P-糖蛋白底物或抑制劑*

    2013-04-04 01:05:41徐佳向志雄劉海燕
    上海醫(yī)藥 2013年13期
    關鍵詞:素鈉紫杉醇底物

    徐佳 向志雄 劉海燕

    (上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203)

    類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種常見且頑固的慢性全身性自身免疫系統(tǒng)疾病,多數(shù)免疫抑制劑對機體免疫系統(tǒng)的作用缺乏特異性和選擇性,毒副作用大,限制了其廣泛使用[1-2]。(5R)-5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇(簡稱T8)是我院正在開發(fā)的用于治療類風濕性關節(jié)炎的一類創(chuàng)新藥物,與其先導化合物雷公藤內(nèi)酯醇相比,具有更強的成藥性[3]。該化合物目前已經(jīng)進入I期臨床研究階段,需要評價其藥物-藥物相互作用的可能性。

    P-gp是由多藥耐藥1基因(mdr1)編碼的ATP依賴性膜蛋白,作為藥物泵出轉運子的P-gp可在許多組織中表達,是某些藥物的生物利用度低下和產(chǎn)生藥物-藥物相互作用或藥物-食物相互作用的原因[4-7]。P-gp分子上有多個藥物結合位點,故其底物范圍非常廣泛。由于P-gp底物和分布的廣泛性,在合用藥物時,可能發(fā)生競爭性或非競爭性的藥物相互作用,影響藥動學過程,引起臨床療效的改變或產(chǎn)生毒性[8-9]。美國食品和藥品管理局(FDA)規(guī)定須從藥物代謝動力學角度評價化合物是否是P-gp的底物或抑制劑[10]。

    人類mdr1基因轉染犬腎上皮細胞系MDCK(Madin-Daby canine kidney)后形成 MDCK-MDR1細胞系,融合后形成不規(guī)則的多層細胞膜,P-gp 在上層細胞膜上高表達,專一性地用來判斷藥物是否是依賴P-gp轉運的底物或抑制劑,可利用其作為腸道黏膜和血腦屏障藥物透過性的體外快速篩選模型[11-13]。我們利用MDCK-MDR1細胞模型快速預測T8是否是依賴P-gp介導的底物或抑制劑,為臨床藥物-藥物相互作用研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥品與試劑

    培養(yǎng)基:高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco),含肝素 (國藥集團化學試劑有限公司) 50 mg/L、谷氨酰胺(Gibco)200 mg/L( 用 NaHCO3調(diào) pH 7.2 ~ 7.4)、雙抗生素(100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素,Gibco)10 ml/L、10%(v/v)胎牛血清 FBS(Gibco)、用 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,4 ℃保存;胰蛋白酶0.25%(w/v)Trypsin-EDTA(Gibco);熒光素鈉(國藥集團化學試劑有限公司);阿替洛爾(中國藥品生物制品檢定所);普萘洛爾(中國藥品生物制品檢定所);紫杉醇(本院藥物制劑室);Rho123(美國Sigma公司);環(huán)孢素 A(美國Sigma公司,簡稱CsA);替硝唑(Sigma);雙氯芬酸(中國藥品生物制品檢定所);MDCK-MDR1細胞系; T8由我院合成室提供,結構式見圖1。試驗用水為滅菌去離子水,其他試劑均為國產(chǎn)分析純及以上規(guī)格。

    圖1 T8的結構式

    1.1.2 實驗儀器

    細胞電阻儀(Millicell-ERS voltohmmeter,美國Millipore 公司);Millipore 插入式培養(yǎng)器(PCF 膜,膜孔徑0.4 μm,直徑12 mm,美國Millipore 公司);24孔培養(yǎng)板(美國Corning公司); 生物安全柜(美國Labconco公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);TS100 型倒置顯微鏡(日本尼康公司); CBS-47液氮罐; ZHWY-103B多振幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司); 酶標儀 (Thermo Varioskan Flash,美國Thermo Fisher Scientific公司);API4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 Applied Biosystem公司),配有電噴霧離子源(ESI)以及Analyst 1.5.1 數(shù)據(jù)處理軟件;Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)(美國 Waters 公司),包括四元輸液泵,自動進樣器。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)

    將需復蘇的細胞移至含20 ml高糖DMEM細胞培養(yǎng)液的T-75組織培養(yǎng)瓶中置于37 ℃培養(yǎng)箱于5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng),待細胞長滿單層后進行傳代點板,接種(1.5×105個細胞/ml)到轉運系統(tǒng)(Millipore 插入式培養(yǎng)器和24孔培養(yǎng)板組成轉運系統(tǒng),見圖2)的PCF膜的AP側,每孔0.4 ml,以后每天換液培養(yǎng)至第4天進行實驗。

    圖2 轉運系統(tǒng)圖示

    1.2.2 MDCK-MDR1細胞模型的完整性考察

    將MDCK-MDR1細胞培養(yǎng)至第4天,以熒光素鈉和阿替洛爾作為吸收性差的檢漏藥物對細胞模型進行評價。轉運實驗方案為將熒光素鈉(終濃度10 μmol/L)或阿替洛爾(終濃度1 μmol/L)分別從AP側給藥(接收側加入空白Hanks溶液,BL側0.6 ml),90 min后從BL側取細胞通透液(n=3)。

    1.2.3 評價T8是否是P-gp的底物

    細胞培養(yǎng)至第4天進行轉運實驗。第一組,在轉運系統(tǒng)兩側加入空白Hanks溶液(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),平衡10 min后輕輕吸出。轉運實驗方案為將T8(終濃度1 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入空白Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第二組:分別在AP側和BL側加入含CsA終濃度為10 μmol/L的Hanks溶液(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),平衡10 min后輕輕吸出。轉運實驗方案為將T8(終濃度1 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和P-gp抑制劑CsA(終濃度10 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入含CsA濃度為10 μmol/L的Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。以Rho123和紫杉醇為陽性對照(也合用普萘洛爾為內(nèi)參物),方案為將上述轉運方案中的T8(終濃度1 μmol/L)替換為 Rho123(終濃度 5 μmol/L)或紫杉醇(終濃度 5 μmol/L)。

    1.2.4 評價T8是否是P-gp的抑制劑

    細胞培養(yǎng)至第4天進行轉運實驗時,分別以Rho123和紫杉醇為底物、CsA為P-gp的陽性抑制劑。以Rho123為底物時,在轉運系統(tǒng)兩側加入空白Hanks溶液(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),平衡10 min后輕輕吸出,第一組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入空白Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第二組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和CsA(終濃度10 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入含CsA終濃度為10 μmol/L的Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第三組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和T8(終濃度1 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第四組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和 T8(終濃度 5 μmol/L)合用,分別從 AP側和BL側給藥(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。以紫杉醇為底物,方案為將上述轉運方案中的Rho123(終濃度5 μmol/L)替換為紫杉醇(終濃度 5 μmol/L)。

    1.2.5 樣品處理方法

    100 μl細胞通透液加入100 μl含內(nèi)標替硝唑(0.1 μg/ml)的乙腈,混合10 min沉淀蛋白,離心(6 000 g,10 min)后取70 μl加入96孔板,用串聯(lián)質(zhì)譜儀對化合物T8和陽性對照紫杉醇、阿替洛爾和普萘洛爾進行定量測定。T8的內(nèi)標為含0.5 μmol/L的雙氯芬酸,陽性對照紫杉醇、阿替洛爾和普萘洛爾的內(nèi)標為0.1 μg/ml的替硝唑。

    1.2.6 樣品測定方法

    1)色譜條件 色譜柱 :BEH C18(1.7 μm,50 mm× 2.1 mm 內(nèi)徑,美國Waters 公司);流速:0.3 ml/min;柱溫:30 ℃;自動進樣器溫度:4 ℃;進樣量:5 μl。

    2)質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI),檢測方式: T8和雙氯芬酸為負離子檢測,其余化合物為正離子檢測;離子源溫度(TEM): 400 ℃;霧化氣(Gas1,N2)壓力:50 psi;輔助氣(Gas2,N2)壓力:50 psi;氣簾氣(CUR)壓力:10 psi;掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM);碰撞氣(CAD,N2)壓力:中;用于定量分析的離子反應如表1。

    表1 質(zhì)譜條件

    3) Rho123和熒光素鈉測定 用Thermo Varioskan Flash 酶標儀測定Rho123和熒光素鈉此類質(zhì)譜響應差但有熒光吸收的物質(zhì)。Rho123的激發(fā)波長為498 nm 發(fā)射波長為530 nm;熒光素鈉的激發(fā)波長為491 nm,發(fā)射波長為514 nm。

    1.2.7 數(shù)據(jù)分析

    1)評價T8是否是P-gp的底物 表觀透過系數(shù)Papp的計算公式如下[10]:

    公式中:表觀透過系數(shù)Papp(cm/s)反映藥物在腸上皮細胞中藥物的滲透能力;VR表示接收室的溶液體積(ml);A表示膜的面積(此時A為0.6 cm2);C0表示供試液中藥物的起始濃度(μg/ml);dC/dt表示接收室在單位時間獲得的藥物濃度[μg/(ml·s)]。分別計算AP側向BL 側轉運的Papp(AP-BL)和 BL 側向 AP 側轉運的Papp(BL-AP)。外排比(Efflux Ratio)的計算公式如下:

    MDCK-MDR1細胞實驗中以校正外排比(Corrected Efflux Ratio,CER)表示P-gp外排能力:

    Efflux RatioMDR1為BL-AP以及AP-BL方向底物的表觀透過系數(shù)比值;Efflux RatioWILDTYPE為抑制劑CsA存在條件下底物兩個方向的表觀透過系數(shù)比值。

    2) 評價T8是否是P-gp的抑制劑 抑制率(Inhibition Degree)按下式計算[14-15]

    Papp(BL-AP)和Papp(AP-BL)分別為BL-AP以及AP-BL方向底物的表觀透過系數(shù)。iPapp(BL-AP)和iPapp(AP-BL)分別為抑制劑存在條件下底物兩個方向的表觀透過系數(shù)。

    2 實驗結果

    2.1 MDCK-MDR1細胞模型的完整性考察

    當MDCK-MDR1細胞培養(yǎng)至第4天時,以熒光素鈉和阿替洛爾作為吸收性差的檢漏藥物、普萘洛爾為陰性對照(確定不是P-gp底物)、Rho123和紫杉醇為陽性對照(確定是P-gp底物)合并給藥,并且結合細胞的跨膜電阻和形態(tài)學指標來對MDCK-MDR1細胞模型進行評價。

    1)光學顯微鏡觀察結果 可見細胞生長均勻,邊界清晰(圖3)。

    2)細胞的跨膜電阻(TEER值) 每天測電阻,電阻會呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第4天做轉運實驗,Hanks溶液中的電阻約為 50~ 100 Ω·cm2。

    3)檢漏標記物 MDCK在Millicell PCF 膜上生長4 d后,AP側到BL側方向,10 μmol/L熒光素鈉和1 μmol/L 的阿替洛爾的Papp分別為 9.79×10-7cm/s和8.81×10-7cm/s,滿足實驗要求,和文獻報道一致[16],表明MDCK-MDR1細胞間隙建立,細胞模型建立成功。

    圖3 顯微鏡下MDCK 細胞形態(tài)(40×)

    4)對照化合物 當 MDCK-MDR1細胞模型長至第4天時,以普萘洛爾為陰性對照(確定不是P-gp底物),實驗結果數(shù)值接近1;以Rho123和紫杉醇為陽性對照(確定是P-gp底物),實驗結果數(shù)值大于2;表明MDCKMDR1細胞模型建立成功。

    2.2 評價T8是否是P-gp的底物實驗結果

    結果(表2)提示T8是高透過性化合物,T8的外排比為1.07,F(xiàn)DA規(guī)定外排比大于2即為P-gp的潛在底物[10],所以T8不是P-gp的潛在底物。

    表2 T8的表觀透過系數(shù)和校正外排比

    2.3 評價T8是否是P-gp的抑制劑實驗結果

    分別以Rho123(表3)和紫杉醇(表4)為底物時,1 μmol/L和5 μmol/L的T8對這兩個底物的轉運沒有影響,外排比基本沒有改變,抑制率基本為0,因此T8不是P-gp的抑制劑。

    3 討論

    MDCK-MDR1 細胞培養(yǎng)周期短,代與代之間均一性良好,并且獲得了P-gp的高表達,因此是研究藥物雙向轉運率、吸收轉運機制、預測體內(nèi)吸收和藥物相互作用、新藥設計、快速篩選及評價藥物安全性的一個較為理想的體外模型[14]。本研究結果表明T8的轉運不受P-gp外排的影響,但是T8的轉運過程是否存在其他影響因子(如其他多藥耐藥性蛋白、ATP 酶以及細胞間隙等因素)尚需進一步的研究。

    表3 以Rho123為底物的T8抑制率

    表4 以紫杉醇為底物的T8抑制率

    藥物進出細胞的方式包括主動轉運、被動轉運、細胞旁路通過及胞吞。熒光素鈉和阿替洛爾以細胞旁路通過的方式進入細胞,因此采用其來檢測單層細胞的完整性,測定方法簡單、快捷、可靠[16]。

    本研究中選用普萘洛爾作為內(nèi)參物與T8以及每個P-gp底物共同給藥,目的是更好地監(jiān)測MDCK細胞上P-gp的功能,其校正外排比基本都在1左右或低于1。有文獻報道[17-18]普萘洛爾不受P-gp轉運的影響,但可能對P-gp的功能有一定影響。我們的實驗結果表明普萘洛爾不影響P-gp的功能,因為陽性藥的結果都符合要求。

    根據(jù)臨床前動物實驗,預測I期臨床試驗中最大給藥劑量為4~8 mg,推測人體最大血藥濃度0.5~1 μmol/L,因此底物實驗中濃度設置為1 μmol/L,抑制劑實驗中濃度設置為1 μmol/L 和 5 μmol/L。

    總體結果表明T8既不是P-gp的底物也不是P-gp的抑制劑,因此在吸收、分布、代謝以及排泄階段T8與P-gp的抑制劑和底物發(fā)生相互作用的可能性很小。

    [1] 張品南, 陳艷梅.內(nèi)風濕關節(jié)炎的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志, 2008, 11(1): 59-61.

    [2] 劉春芳, 林娜.雷公藤甲素抗類風濕性關節(jié)炎機制研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2006, 31(19): 1575-1579.

    [3] Zhou R, Zhang F, He PL,et al.(5R)-5-hydroxytriptolide(LLDT-8), a novel triptolide analog mediates immunosuppressive effectsin vitroandin vivo[J]. Int Immunopharmacol, 2005, 5 (13-14): 1895-1903.

    [4] 劉瑤, 曾蘇.MDCK-MDR1細胞模型及其在藥物透過研究中的應用進展[J].藥學學報, 2008, 43(6): 559-564.

    [5] Polli JW, Wring SA, Humphreys JE,et al.Rational use ofin vitroP-glycoprotein assays in drug discovery [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2001, 299(2) : 620-628.

    [6] Simons K, Ikonen E. Functional rafts in cell membranes[J].Nature, 1997, 387(6633): 569-572.

    [7] Luker GD, Pica CM, Kumar AS,et al.Effects of cholesterol and enantiomeric cholesterol on P-glycoprotein localization and function in low-density membrane domains[J].Biochemistry, 2000, 39(26): 7651-7661.

    [8] Tang F, Horie K, Borchardt RT.Are MDCK cells transfected with the human MDR1 gene a good model of the human intestinal mucosa? [J]. Pharm Res, 2002, 19(6): 765-772.

    [9] Gumbleton M, Audus KL.Progress and limitations in the use ofin vitrocell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier[J]. J Pharm Sci, 2001, 90(11):1681-1698.

    [10] Guidance for industry: drug interaction studies - study design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations[EB/OL]. [2013-01-14]. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInfor mation/Guidances/ucm292362.pdf.

    [11] Veronesi B.Characterization of the MDCK cell line for screening neurotoxicants[J]. Neurotoxicology, 1996, 17(2):433-443.

    [12] Irvine JD, Takahashi L, Lockhart K,et al.MDCK ( Madin-Darby canine kidney) cells: a tool for membrane permeability screening[J]. J Pharm Sci, 1999, 88(1): 28-33.

    [13] Pastan I, Gottesman MM, Ueda K,et al.A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85(12): 4486-4490.

    [14] Balimane PV, Patel K, Marino A,et al.Utility of 96 wellCaco-2 cell system for increased throughput of P-gp screening in drug discovery[J].Eur J Pharm Biopharm, 2004, 58(1):99-105.

    [15] Kim RB, Wandel C, Leake B,et al.Interrelationship between substrates and inhibitors of human CYP3A and P-glycoprotein[J]. Pharm Res, 1999, 16(3): 408-414.

    [16] Rusinko A, Hellberg MR, May JA,et al. Use of MDCK cell line to predict corneal penetration of drug.US 7297505[P].2005-10-27.

    [17] Bachmakov I, Werner U, Endress B,et al.Characterization of beta-adrenoceptor antagonists as substrates and inhibitors of the drug transporter P-glycoprotein[J]. Fundam Clin Pharmacol, 2006, 20(3): 273-282.

    [18] Collett A, Tanianis-Hughes J, Warhurst G. Rapid induction of P-glycoprotein expression by high permeability compounds in colonic cellsin vitro: a possible source of transporter mediated drug interactions? [J]. Biochem Pharmacol, 2004,68(4): 783-790.

    猜你喜歡
    素鈉紫杉醇底物
    兩種品牌大腸菌群酶底物法檢測試劑性能的比較
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:30:56
    解析參與植物脅迫應答的蛋白激酶—底物網(wǎng)絡
    科學(2020年2期)2020-08-24 07:57:00
    熒光分光光度法測定水中示蹤劑熒光素鈉示蹤劑
    紫杉醇脂質(zhì)體與紫杉醇不同途徑灌注治療兔舌癌的療效研究
    脂質(zhì)體紫杉醇周療方案與普通紫杉醇治療乳腺癌的療效及不良反應比較
    護理干預對預防紫杉醇過敏反應療效觀察
    泛素連接酶-底物選擇關系的研究進展
    貝前列素鈉對全腦缺血/再灌注大鼠腦損傷的作用及機制
    紫杉醇新劑型的研究進展
    新魚腥草素鈉注射液制劑處方及工藝的研究
    海峽科學(2013年3期)2013-10-21 05:18:12
    亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产 精品1| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费人妻精品一区二区三区视频| 不卡av一区二区三区| 国产一区二区激情短视频 | 日本91视频免费播放| 亚洲精品视频女| 午夜激情av网站| 男的添女的下面高潮视频| 在现免费观看毛片| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲av男天堂| 精品亚洲成a人片在线观看| 午夜av观看不卡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美国免费a级毛片| 五月开心婷婷网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久久久精品人妻al黑| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产成人一区二区在线| 天堂8中文在线网| 免费在线观看完整版高清| 精品一区二区三区av网在线观看 | 色吧在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲国产精品国产精品| 七月丁香在线播放| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 免费高清在线观看日韩| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产欧美网| 亚洲国产精品成人久久小说| 成年人午夜在线观看视频| 免费观看av网站的网址| 亚洲四区av| 视频在线观看一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 青草久久国产| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 一个人免费看片子| av网站在线播放免费| 成人免费观看视频高清| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99久久人妻综合| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 丁香六月欧美| 男女免费视频国产| 国产精品久久久久久精品古装| 桃花免费在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美日本中文国产一区发布| 毛片一级片免费看久久久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美精品一区二区免费开放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜福利,免费看| 国产高清不卡午夜福利| 日韩一区二区视频免费看| 午夜91福利影院| 国产精品国产三级专区第一集| 涩涩av久久男人的天堂| 中国国产av一级| av.在线天堂| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人精品福利久久| www日本在线高清视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 自线自在国产av| 男女国产视频网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 一级黄片播放器| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲欧美成人精品一区二区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av中文av极速乱| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人啪精品午夜网站| 色94色欧美一区二区| 久久人人爽人人片av| 亚洲美女视频黄频| 赤兔流量卡办理| 国产免费一区二区三区四区乱码| 伊人亚洲综合成人网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久久久久久久久免费av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 美女主播在线视频| 久久婷婷青草| 日韩欧美精品免费久久| 香蕉国产在线看| 精品国产一区二区三区四区第35| 综合色丁香网| 一级片免费观看大全| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲七黄色美女视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 狂野欧美激情性bbbbbb| 少妇被粗大猛烈的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲综合精品二区| 99香蕉大伊视频| 国产精品国产av在线观看| 99九九在线精品视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 美女午夜性视频免费| 嫩草影院入口| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产色婷婷99| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 两性夫妻黄色片| 国产av一区二区精品久久| 国产精品久久久久成人av| 日本wwww免费看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 狂野欧美激情性xxxx| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 青春草亚洲视频在线观看| 久久99一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲四区av| 涩涩av久久男人的天堂| 热re99久久国产66热| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久女婷五月综合色啪小说| 妹子高潮喷水视频| 欧美精品av麻豆av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 波多野结衣av一区二区av| 午夜91福利影院| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产一区二区激情短视频 | 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产不卡av网站在线观看| 欧美97在线视频| 天天影视国产精品| 精品亚洲成国产av| av在线app专区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久午夜综合久久蜜桃| 91国产中文字幕| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 丰满饥渴人妻一区二区三| 中国国产av一级| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久av网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 最黄视频免费看| 中国三级夫妇交换| 欧美国产精品一级二级三级| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲精品日本国产第一区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久久网色| 免费观看性生交大片5| 精品久久久久久电影网| 国产伦人伦偷精品视频| 秋霞伦理黄片| 日韩一区二区三区影片| 欧美另类一区| 日本av免费视频播放| 成人免费观看视频高清| 在线观看人妻少妇| 国产精品久久久久久精品电影小说| svipshipincom国产片| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品二区激情视频| 另类精品久久| 国产成人免费无遮挡视频| 日日撸夜夜添| 国产免费福利视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 97精品久久久久久久久久精品| 久久综合国产亚洲精品| 18在线观看网站| 久久久久精品人妻al黑| 日日啪夜夜爽| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美日韩视频精品一区| av有码第一页| 搡老岳熟女国产| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久网色| 国产精品女同一区二区软件| 少妇人妻 视频| 国产成人91sexporn| 超碰成人久久| 精品一区二区三区av网在线观看 | 超碰97精品在线观看| 中文字幕高清在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日本欧美国产在线视频| 一个人免费看片子| 亚洲精品在线美女| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 搡老乐熟女国产| 国产男人的电影天堂91| 久久性视频一级片| 午夜福利在线免费观看网站| 国产免费又黄又爽又色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产免费一区二区三区四区乱码| 新久久久久国产一级毛片| 在线免费观看不下载黄p国产| 午夜福利视频精品| 欧美国产精品一级二级三级| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久99一区二区三区| 捣出白浆h1v1| 在线观看www视频免费| 亚洲成人手机| 免费不卡黄色视频| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲人成77777在线视频| 欧美97在线视频| 亚洲精品国产av蜜桃| www日本在线高清视频| xxxhd国产人妻xxx| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一区在线观看完整版| 久久99一区二区三区| 黄色一级大片看看| av视频免费观看在线观看| 亚洲专区中文字幕在线 | 看免费成人av毛片| 精品视频人人做人人爽| 熟妇人妻不卡中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久影院123| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 男女之事视频高清在线观看 | 高清不卡的av网站| 欧美国产精品一级二级三级| 性少妇av在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 人体艺术视频欧美日本| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品国产av在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 三上悠亚av全集在线观看| 久久婷婷青草| 亚洲av国产av综合av卡| av片东京热男人的天堂| 中文字幕最新亚洲高清| 好男人视频免费观看在线| 国产亚洲av高清不卡| 丁香六月天网| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 一级黄片播放器| 欧美日韩精品网址| 在线 av 中文字幕| 最近手机中文字幕大全| 午夜日韩欧美国产| 高清不卡的av网站| 午夜免费鲁丝| 国产精品欧美亚洲77777| 国产亚洲欧美精品永久| 日本vs欧美在线观看视频| 伦理电影免费视频| 国产 精品1| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美日韩综合久久久久久| 中文欧美无线码| 国产男女内射视频| 黄色毛片三级朝国网站| 97精品久久久久久久久久精品| 精品一区二区三卡| 日韩电影二区| 成年动漫av网址| 天天影视国产精品| 搡老岳熟女国产| 午夜影院在线不卡| 日本欧美视频一区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 嫩草影视91久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲国产精品国产精品| 成年av动漫网址| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久久久久人妻| 纯流量卡能插随身wifi吗| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品国产区一区二| 超碰97精品在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99热全是精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 九色亚洲精品在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜日韩欧美国产| 精品少妇久久久久久888优播| xxxhd国产人妻xxx| 久久 成人 亚洲| 在现免费观看毛片| 亚洲综合精品二区| 老司机影院成人| 曰老女人黄片| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区国产| 最近的中文字幕免费完整| 久久人人爽人人片av| 热re99久久精品国产66热6| 国产一级毛片在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 国产男女内射视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 综合色丁香网| 久久国产亚洲av麻豆专区| netflix在线观看网站| av不卡在线播放| 女性被躁到高潮视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久精品区二区三区| 久久久久久久国产电影| 97在线人人人人妻| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 最近的中文字幕免费完整| 在线观看www视频免费| 婷婷色av中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| 欧美av亚洲av综合av国产av | 制服诱惑二区| 国产国语露脸激情在线看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女午夜性视频免费| 国产av一区二区精品久久| 亚洲国产精品999| www.av在线官网国产| 国产av精品麻豆| 天天操日日干夜夜撸| 欧美日韩成人在线一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 桃花免费在线播放| 国产激情久久老熟女| 精品少妇久久久久久888优播| 色播在线永久视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 青青草视频在线视频观看| 搡老岳熟女国产| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产福利在线免费观看视频| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美日韩av久久| 十八禁网站网址无遮挡| 一本色道久久久久久精品综合| 一级毛片电影观看| 久久97久久精品| 日本欧美国产在线视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 自线自在国产av| 成年动漫av网址| 黄色视频不卡| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人手机av| 十分钟在线观看高清视频www| 成人三级做爰电影| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费日韩欧美在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 精品人妻一区二区三区麻豆| 考比视频在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久精品人人爽人人爽视色| 人成视频在线观看免费观看| 男人操女人黄网站| 亚洲av福利一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品福利永久在线观看| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 宅男免费午夜| 午夜av观看不卡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲伊人色综图| 免费观看av网站的网址| 少妇被粗大猛烈的视频| av一本久久久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 91成人精品电影| 美女主播在线视频| 午夜久久久在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲欧美色中文字幕在线| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品 国内视频| 亚洲免费av在线视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 老司机在亚洲福利影院| 国产在线一区二区三区精| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线看a的网站| 好男人视频免费观看在线| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品女同一区二区软件| 日韩电影二区| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩一区二区三区影片| 男女下面插进去视频免费观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日日撸夜夜添| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 韩国精品一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲成人手机| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 1024香蕉在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久久精品人妻al黑| 一级片'在线观看视频| 国产深夜福利视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 日日撸夜夜添| 999久久久国产精品视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久久久久久久久大奶| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲人成77777在线视频| 久久 成人 亚洲| 成年人免费黄色播放视频| 国产成人av激情在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 9色porny在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 18禁观看日本| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近手机中文字幕大全| 国产av精品麻豆| netflix在线观看网站| 午夜福利免费观看在线| 美女福利国产在线| 黄色一级大片看看| 免费观看性生交大片5| 大香蕉久久网| 看免费av毛片| 久久久久久久久久久免费av| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲人成77777在线视频| 好男人视频免费观看在线| 国产精品一区二区在线观看99| 久久久久久久精品精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 热re99久久国产66热| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 大香蕉久久网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 大香蕉久久网| 国产1区2区3区精品| 黄色视频不卡| 观看美女的网站| 另类亚洲欧美激情| 中国三级夫妇交换| 国产野战对白在线观看| av福利片在线| 性色av一级| 日韩大码丰满熟妇| 一边摸一边做爽爽视频免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av片东京热男人的天堂| 国产成人欧美| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美激情在线| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 天天添夜夜摸| 伦理电影免费视频| 精品人妻在线不人妻| 久久久久精品国产欧美久久久 | 黑丝袜美女国产一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美日韩视频精品一区| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 99热全是精品| 两性夫妻黄色片| 超碰97精品在线观看| 国产精品一国产av| 婷婷成人精品国产| 免费观看a级毛片全部| 亚洲成人一二三区av| 制服诱惑二区| 18禁动态无遮挡网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品蜜桃在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久久国产电影| 男人操女人黄网站| 飞空精品影院首页| 成人国产麻豆网| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲精品乱久久久久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品久久蜜臀av无| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲综合色网址| 久久婷婷青草| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产成人免费无遮挡视频| 欧美最新免费一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品 国内视频| av女优亚洲男人天堂| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 观看美女的网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看| kizo精华| 亚洲欧洲日产国产| 男女床上黄色一级片免费看| 国产人伦9x9x在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 国产1区2区3区精品| 90打野战视频偷拍视频| 一本久久精品| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产免费福利视频在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 男女边摸边吃奶| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 午夜激情久久久久久久| 国产av一区二区精品久久| 久久热在线av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品久久久精品久久久| 人成视频在线观看免费观看| 免费黄色在线免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 蜜桃国产av成人99| 日韩伦理黄色片| 最近2019中文字幕mv第一页| 两性夫妻黄色片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 男女下面插进去视频免费观看| 欧美日韩av久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 激情视频va一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产成人免费观看mmmm| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品国产国语对白av|