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    5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇不是P-糖蛋白底物或抑制劑*

    2013-04-04 01:05:41徐佳向志雄劉海燕
    上海醫(yī)藥 2013年13期
    關鍵詞:素鈉紫杉醇底物

    徐佳 向志雄 劉海燕

    (上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203)

    類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種常見且頑固的慢性全身性自身免疫系統(tǒng)疾病,多數(shù)免疫抑制劑對機體免疫系統(tǒng)的作用缺乏特異性和選擇性,毒副作用大,限制了其廣泛使用[1-2]。(5R)-5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇(簡稱T8)是我院正在開發(fā)的用于治療類風濕性關節(jié)炎的一類創(chuàng)新藥物,與其先導化合物雷公藤內(nèi)酯醇相比,具有更強的成藥性[3]。該化合物目前已經(jīng)進入I期臨床研究階段,需要評價其藥物-藥物相互作用的可能性。

    P-gp是由多藥耐藥1基因(mdr1)編碼的ATP依賴性膜蛋白,作為藥物泵出轉運子的P-gp可在許多組織中表達,是某些藥物的生物利用度低下和產(chǎn)生藥物-藥物相互作用或藥物-食物相互作用的原因[4-7]。P-gp分子上有多個藥物結合位點,故其底物范圍非常廣泛。由于P-gp底物和分布的廣泛性,在合用藥物時,可能發(fā)生競爭性或非競爭性的藥物相互作用,影響藥動學過程,引起臨床療效的改變或產(chǎn)生毒性[8-9]。美國食品和藥品管理局(FDA)規(guī)定須從藥物代謝動力學角度評價化合物是否是P-gp的底物或抑制劑[10]。

    人類mdr1基因轉染犬腎上皮細胞系MDCK(Madin-Daby canine kidney)后形成 MDCK-MDR1細胞系,融合后形成不規(guī)則的多層細胞膜,P-gp 在上層細胞膜上高表達,專一性地用來判斷藥物是否是依賴P-gp轉運的底物或抑制劑,可利用其作為腸道黏膜和血腦屏障藥物透過性的體外快速篩選模型[11-13]。我們利用MDCK-MDR1細胞模型快速預測T8是否是依賴P-gp介導的底物或抑制劑,為臨床藥物-藥物相互作用研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥品與試劑

    培養(yǎng)基:高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco),含肝素 (國藥集團化學試劑有限公司) 50 mg/L、谷氨酰胺(Gibco)200 mg/L( 用 NaHCO3調(diào) pH 7.2 ~ 7.4)、雙抗生素(100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素,Gibco)10 ml/L、10%(v/v)胎牛血清 FBS(Gibco)、用 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,4 ℃保存;胰蛋白酶0.25%(w/v)Trypsin-EDTA(Gibco);熒光素鈉(國藥集團化學試劑有限公司);阿替洛爾(中國藥品生物制品檢定所);普萘洛爾(中國藥品生物制品檢定所);紫杉醇(本院藥物制劑室);Rho123(美國Sigma公司);環(huán)孢素 A(美國Sigma公司,簡稱CsA);替硝唑(Sigma);雙氯芬酸(中國藥品生物制品檢定所);MDCK-MDR1細胞系; T8由我院合成室提供,結構式見圖1。試驗用水為滅菌去離子水,其他試劑均為國產(chǎn)分析純及以上規(guī)格。

    圖1 T8的結構式

    1.1.2 實驗儀器

    細胞電阻儀(Millicell-ERS voltohmmeter,美國Millipore 公司);Millipore 插入式培養(yǎng)器(PCF 膜,膜孔徑0.4 μm,直徑12 mm,美國Millipore 公司);24孔培養(yǎng)板(美國Corning公司); 生物安全柜(美國Labconco公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);TS100 型倒置顯微鏡(日本尼康公司); CBS-47液氮罐; ZHWY-103B多振幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司); 酶標儀 (Thermo Varioskan Flash,美國Thermo Fisher Scientific公司);API4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 Applied Biosystem公司),配有電噴霧離子源(ESI)以及Analyst 1.5.1 數(shù)據(jù)處理軟件;Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)(美國 Waters 公司),包括四元輸液泵,自動進樣器。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)

    將需復蘇的細胞移至含20 ml高糖DMEM細胞培養(yǎng)液的T-75組織培養(yǎng)瓶中置于37 ℃培養(yǎng)箱于5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng),待細胞長滿單層后進行傳代點板,接種(1.5×105個細胞/ml)到轉運系統(tǒng)(Millipore 插入式培養(yǎng)器和24孔培養(yǎng)板組成轉運系統(tǒng),見圖2)的PCF膜的AP側,每孔0.4 ml,以后每天換液培養(yǎng)至第4天進行實驗。

    圖2 轉運系統(tǒng)圖示

    1.2.2 MDCK-MDR1細胞模型的完整性考察

    將MDCK-MDR1細胞培養(yǎng)至第4天,以熒光素鈉和阿替洛爾作為吸收性差的檢漏藥物對細胞模型進行評價。轉運實驗方案為將熒光素鈉(終濃度10 μmol/L)或阿替洛爾(終濃度1 μmol/L)分別從AP側給藥(接收側加入空白Hanks溶液,BL側0.6 ml),90 min后從BL側取細胞通透液(n=3)。

    1.2.3 評價T8是否是P-gp的底物

    細胞培養(yǎng)至第4天進行轉運實驗。第一組,在轉運系統(tǒng)兩側加入空白Hanks溶液(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),平衡10 min后輕輕吸出。轉運實驗方案為將T8(終濃度1 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入空白Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第二組:分別在AP側和BL側加入含CsA終濃度為10 μmol/L的Hanks溶液(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),平衡10 min后輕輕吸出。轉運實驗方案為將T8(終濃度1 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和P-gp抑制劑CsA(終濃度10 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入含CsA濃度為10 μmol/L的Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。以Rho123和紫杉醇為陽性對照(也合用普萘洛爾為內(nèi)參物),方案為將上述轉運方案中的T8(終濃度1 μmol/L)替換為 Rho123(終濃度 5 μmol/L)或紫杉醇(終濃度 5 μmol/L)。

    1.2.4 評價T8是否是P-gp的抑制劑

    細胞培養(yǎng)至第4天進行轉運實驗時,分別以Rho123和紫杉醇為底物、CsA為P-gp的陽性抑制劑。以Rho123為底物時,在轉運系統(tǒng)兩側加入空白Hanks溶液(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),平衡10 min后輕輕吸出,第一組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入空白Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第二組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和CsA(終濃度10 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(接收側加入含CsA終濃度為10 μmol/L的Hanks溶液,AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第三組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和T8(終濃度1 μmol/L)合用,分別從AP側和BL側給藥(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。第四組轉運實驗方案為將Rho123(終濃度5 μmol/L)和普萘洛爾(終濃度5 μmol/L)和 T8(終濃度 5 μmol/L)合用,分別從 AP側和BL側給藥(AP側0.4 ml,BL側0.6 ml),90 min后分別從BL側和AP側取細胞通透液(n=3)。以紫杉醇為底物,方案為將上述轉運方案中的Rho123(終濃度5 μmol/L)替換為紫杉醇(終濃度 5 μmol/L)。

    1.2.5 樣品處理方法

    100 μl細胞通透液加入100 μl含內(nèi)標替硝唑(0.1 μg/ml)的乙腈,混合10 min沉淀蛋白,離心(6 000 g,10 min)后取70 μl加入96孔板,用串聯(lián)質(zhì)譜儀對化合物T8和陽性對照紫杉醇、阿替洛爾和普萘洛爾進行定量測定。T8的內(nèi)標為含0.5 μmol/L的雙氯芬酸,陽性對照紫杉醇、阿替洛爾和普萘洛爾的內(nèi)標為0.1 μg/ml的替硝唑。

    1.2.6 樣品測定方法

    1)色譜條件 色譜柱 :BEH C18(1.7 μm,50 mm× 2.1 mm 內(nèi)徑,美國Waters 公司);流速:0.3 ml/min;柱溫:30 ℃;自動進樣器溫度:4 ℃;進樣量:5 μl。

    2)質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI),檢測方式: T8和雙氯芬酸為負離子檢測,其余化合物為正離子檢測;離子源溫度(TEM): 400 ℃;霧化氣(Gas1,N2)壓力:50 psi;輔助氣(Gas2,N2)壓力:50 psi;氣簾氣(CUR)壓力:10 psi;掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM);碰撞氣(CAD,N2)壓力:中;用于定量分析的離子反應如表1。

    表1 質(zhì)譜條件

    3) Rho123和熒光素鈉測定 用Thermo Varioskan Flash 酶標儀測定Rho123和熒光素鈉此類質(zhì)譜響應差但有熒光吸收的物質(zhì)。Rho123的激發(fā)波長為498 nm 發(fā)射波長為530 nm;熒光素鈉的激發(fā)波長為491 nm,發(fā)射波長為514 nm。

    1.2.7 數(shù)據(jù)分析

    1)評價T8是否是P-gp的底物 表觀透過系數(shù)Papp的計算公式如下[10]:

    公式中:表觀透過系數(shù)Papp(cm/s)反映藥物在腸上皮細胞中藥物的滲透能力;VR表示接收室的溶液體積(ml);A表示膜的面積(此時A為0.6 cm2);C0表示供試液中藥物的起始濃度(μg/ml);dC/dt表示接收室在單位時間獲得的藥物濃度[μg/(ml·s)]。分別計算AP側向BL 側轉運的Papp(AP-BL)和 BL 側向 AP 側轉運的Papp(BL-AP)。外排比(Efflux Ratio)的計算公式如下:

    MDCK-MDR1細胞實驗中以校正外排比(Corrected Efflux Ratio,CER)表示P-gp外排能力:

    Efflux RatioMDR1為BL-AP以及AP-BL方向底物的表觀透過系數(shù)比值;Efflux RatioWILDTYPE為抑制劑CsA存在條件下底物兩個方向的表觀透過系數(shù)比值。

    2) 評價T8是否是P-gp的抑制劑 抑制率(Inhibition Degree)按下式計算[14-15]

    Papp(BL-AP)和Papp(AP-BL)分別為BL-AP以及AP-BL方向底物的表觀透過系數(shù)。iPapp(BL-AP)和iPapp(AP-BL)分別為抑制劑存在條件下底物兩個方向的表觀透過系數(shù)。

    2 實驗結果

    2.1 MDCK-MDR1細胞模型的完整性考察

    當MDCK-MDR1細胞培養(yǎng)至第4天時,以熒光素鈉和阿替洛爾作為吸收性差的檢漏藥物、普萘洛爾為陰性對照(確定不是P-gp底物)、Rho123和紫杉醇為陽性對照(確定是P-gp底物)合并給藥,并且結合細胞的跨膜電阻和形態(tài)學指標來對MDCK-MDR1細胞模型進行評價。

    1)光學顯微鏡觀察結果 可見細胞生長均勻,邊界清晰(圖3)。

    2)細胞的跨膜電阻(TEER值) 每天測電阻,電阻會呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第4天做轉運實驗,Hanks溶液中的電阻約為 50~ 100 Ω·cm2。

    3)檢漏標記物 MDCK在Millicell PCF 膜上生長4 d后,AP側到BL側方向,10 μmol/L熒光素鈉和1 μmol/L 的阿替洛爾的Papp分別為 9.79×10-7cm/s和8.81×10-7cm/s,滿足實驗要求,和文獻報道一致[16],表明MDCK-MDR1細胞間隙建立,細胞模型建立成功。

    圖3 顯微鏡下MDCK 細胞形態(tài)(40×)

    4)對照化合物 當 MDCK-MDR1細胞模型長至第4天時,以普萘洛爾為陰性對照(確定不是P-gp底物),實驗結果數(shù)值接近1;以Rho123和紫杉醇為陽性對照(確定是P-gp底物),實驗結果數(shù)值大于2;表明MDCKMDR1細胞模型建立成功。

    2.2 評價T8是否是P-gp的底物實驗結果

    結果(表2)提示T8是高透過性化合物,T8的外排比為1.07,F(xiàn)DA規(guī)定外排比大于2即為P-gp的潛在底物[10],所以T8不是P-gp的潛在底物。

    表2 T8的表觀透過系數(shù)和校正外排比

    2.3 評價T8是否是P-gp的抑制劑實驗結果

    分別以Rho123(表3)和紫杉醇(表4)為底物時,1 μmol/L和5 μmol/L的T8對這兩個底物的轉運沒有影響,外排比基本沒有改變,抑制率基本為0,因此T8不是P-gp的抑制劑。

    3 討論

    MDCK-MDR1 細胞培養(yǎng)周期短,代與代之間均一性良好,并且獲得了P-gp的高表達,因此是研究藥物雙向轉運率、吸收轉運機制、預測體內(nèi)吸收和藥物相互作用、新藥設計、快速篩選及評價藥物安全性的一個較為理想的體外模型[14]。本研究結果表明T8的轉運不受P-gp外排的影響,但是T8的轉運過程是否存在其他影響因子(如其他多藥耐藥性蛋白、ATP 酶以及細胞間隙等因素)尚需進一步的研究。

    表3 以Rho123為底物的T8抑制率

    表4 以紫杉醇為底物的T8抑制率

    藥物進出細胞的方式包括主動轉運、被動轉運、細胞旁路通過及胞吞。熒光素鈉和阿替洛爾以細胞旁路通過的方式進入細胞,因此采用其來檢測單層細胞的完整性,測定方法簡單、快捷、可靠[16]。

    本研究中選用普萘洛爾作為內(nèi)參物與T8以及每個P-gp底物共同給藥,目的是更好地監(jiān)測MDCK細胞上P-gp的功能,其校正外排比基本都在1左右或低于1。有文獻報道[17-18]普萘洛爾不受P-gp轉運的影響,但可能對P-gp的功能有一定影響。我們的實驗結果表明普萘洛爾不影響P-gp的功能,因為陽性藥的結果都符合要求。

    根據(jù)臨床前動物實驗,預測I期臨床試驗中最大給藥劑量為4~8 mg,推測人體最大血藥濃度0.5~1 μmol/L,因此底物實驗中濃度設置為1 μmol/L,抑制劑實驗中濃度設置為1 μmol/L 和 5 μmol/L。

    總體結果表明T8既不是P-gp的底物也不是P-gp的抑制劑,因此在吸收、分布、代謝以及排泄階段T8與P-gp的抑制劑和底物發(fā)生相互作用的可能性很小。

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