國產硫酸黏菌素中B2組分的分離和結構解析

尹大全 袁暉 黃君勤

（上海新亞藥業(yè)有限公司 上海 201203）

硫酸黏菌素，又名硫酸抗敵素或多黏菌素E硫酸鹽，是一種由多種氨基酸和脂肪酸所組成的堿性多肽類抗生素。其作用原理是與細胞膜黏附，改變細胞膜的結構使之通透性變強，細胞因吸收周圍環(huán)境過多的水分而膨脹死亡。由于其具有腎毒性和神經毒性，在過去的幾十年內臨床上使用較少。而近幾年里，隨著“超級耐藥菌”，臨床治療面臨嚴重威脅，老的抗菌藥物硫酸黏菌素和多黏菌素B被再次啟用，作為治療泛耐藥性革蘭陰性桿菌感染的最后選擇[1]。

多黏菌素是從多黏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中分離純化獲得的多肽類抗生素，由于不同菌種所產生的多黏菌素所含氨基酸不同，共有A、B、C、D、E五種多黏菌素，除C外，每一種均包含兩個主要組分，各種多黏菌素的差別只是在3，6和7位上的氨基酸殘基和氨基末端的脂肪酸不同。由于結構相似，各種多黏菌素抗菌譜相似，對幾乎所有革蘭陰性桿菌均有殺菌作用，其中以多黏菌素B和E毒性最小、療效最高[2]。

本研究采用歐洲藥典7.0版中硫酸黏菌素[3]有關物質測定方法，對本公司生產的硫酸黏菌素與歐洲藥典標準品所含有效組分進行了對比研究，并通過制備液相對不同的組分進行了分離純化和結構鑒定，為產品的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，Phenomenex Gemini C18液 相 色 譜 柱（4.6 mm×150 mm, 5 μm）；Waters 2767/2545型制備液相色譜儀，Phenomenex Luna C18制備色譜柱（21.2 mm×250 mm, 5 μm）；Varian 500兆核磁共振儀；液質聯(lián)用LC（Agilent）-MS（API150EX）。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；無水硫酸鈉（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；硫酸黏菌素標準品（EP，批號：002UO2）；硫酸黏菌素（上海新亞藥業(yè)有限公司，批號：1205301，1205302，1205303）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 多黏菌素E組分對比

根據EP7.0版中硫酸黏菌素質量標準所述，硫酸黏菌素中含有5種有效組分，分別為多黏菌素E1、E2、E3、E1-I、E1-7MOA（圖1）。取本公司產品及EP標準品，分別照質量標準中有關物質方法測定，結果顯示本公司三批樣品與EP標準品除保留時間約為15.7 min增加了一個色譜峰外，其他組分基本一致（圖2）。

圖1 硫酸黏菌素結構圖

圖2 硫酸黏菌素組分HPLC色譜圖

2.2 目標組分的分離純化

取硫酸黏菌素樣品（批號：1205301，50 g），經高壓制備液相分離，分別收集不同保留時間段的流份，經C18柱脫鹽，TFA水洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥，得到保留時間為15.7 min的目標組分。該物質為白色粉末，易溶于甲醇和水，HPLC測得其純度在98%以上（圖3）。

2.3 目標組分的化學結構確證

2.3.1 核磁共振（1H-NMR，13C-NMR）

測試單位：中科院上海藥物研究所。

測定條件：D2O為溶劑，TMS為內標，室溫（23℃）。測定數據和解析如下（表1）。

表1 碳譜數據、氫譜數據和多鍵碳氫關系解析

（續(xù)表1）

1H-NMR顯示7.0～7.5 ppm可見有5個芳質子，提示有一取代的苯環(huán)。δ0.5-1.2 ppm顯示有6個甲基峰，且為d峰，提示有-CH(CH3)2。δ4.05-4.42 ppm區(qū)域顯示有12個次甲基峰，符合硫酸黏菌素化學結構中環(huán)肽的10個氨基酸連接位(-NH-CH-CO-)上的-CH，同時還提示有2個蘇氨酸中的-CH(OH)CH3。結合H-HCOSY,ROESY譜對上述氫譜中的質子進行了歸屬，與文獻[4-5]報道多黏菌素B2的化學結構一致。

13C-NMR中顯示有關物質中有55個碳，DEPT譜顯示有12個季碳，19個CH，18個CH2，6個CH3，其中19個CH根據化學位移結合1H-NMR、HMQC和HMBC可分別歸屬為氨基酸連接位上的C有10個，芳環(huán)上有5個CH，及2個末端甲基上CH，2個蘇氨酸上-CH(OH)-CH3。

12個季碳中11個為羰基上的碳，1個為苯丙氨酸中苯環(huán)上的碳；18個-CH2中12個為L-Dab氨基酸，4個為6-MHA上的-CH2，1個為D-Phe上的CH2，1個為L-Leu上的-CH2；6個甲基碳分別為FA上的2個末端甲基，亮氨酸上的2個末端甲基，2個蘇氨酸上的末端甲基。

13C-NMR譜中，各C的歸屬及與相應H的相關關系、遠程相關關系均作了解析，具體歸屬及數據見表1。

通過1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC和HMBC譜，基本確證了目標組分的化學結構與文獻報道的多黏菌素B2一致。

2.3.2 質譜（LC-MS）

測試單位：中科院上海藥物研究所。測定數據和解析如下。

高分辨質譜顯示（m/z）（M+H）+，1189.7411，分子式為C55H97N16O13，理論計算值為1189.7416，誤差為0.05。ESI-MS譜顯示準分子離子峰(m/z)為1190，[M+2H]2+為596，[M+Na]為1212，MS/MS顯示1172為脫去H2O的離子（M+H-18）。963(1190-227)，863(963-100)，762(863-101)和662(762-100)，以上顯示氨基酸的裂解規(guī)律，與文獻報道的多黏菌素B2一致，質譜裂解途徑見圖4。

圖4 多黏菌素B2 ESI/MS/MS質譜裂解途徑

綜上所述，通過NMR和MS譜的解析，高分辨質譜給出的分子量及分子式均與文獻報道的多黏菌素B2一致，故本公司硫酸黏菌素中分離純化獲得的組分鑒定為已知的多黏菌素B2（圖5）。

圖5 多黏菌素B2的結構

3 討論

硫酸黏菌素是由多黏芽孢桿菌經發(fā)酵產生的一種堿性高分子多肽化合物，其組分較為復雜，不同的菌種、培養(yǎng)條件和分離純化方法都可能導致其組分有一定的差別。EP硫酸黏菌素標準品中有效成分為E1、E2、E3、E1-I和E1-7MOA，其中E1和E2為主要成分；實驗研究表明，我公司產品的組分除上述成分外，還包含有B2。目前我公司將此組分作為雜質來控制，限度為3.0%，但該組分同樣也是多黏菌素B中有效抗菌活性成分之一，其原料和注射劑在中國藥典、歐洲藥典和美國藥典中均有收載。

致謝

特別感謝上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司的蔡金娜博士對以上圖譜解析工作提供的技術幫助。

[1] 李然, 王睿, 李碧艷. 多粘菌素對泛耐藥革蘭陰性桿菌嚴重感染臨床應用新進展[J]. 中國藥物應用與檢測, 2009,6(6): 364-367.

[2] 俞文和, 楊紀根. 抗生素工藝學[M]. 沈陽：遼寧科學技術出版社, 1988: 333-336.

[3] European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia 7.0[EB/OL]. [2013-05-28]. http://db.yaozh.com/foreign/EP7.0/0320E.pdf

[4] Orwa JA, Govaerts C, Busson R, et al. Isolation and structural characterization of polymyxin B components[J]. J Chromatogr A, 2001, 912(2): 369-373.

[5] Orwa JA, Govaerts C, Busson R, et al. Isolation and structural characterization of colistin components[J]. J Antibiot, 2001,54(7): 595-599.