黑水虻抗菌肽誘導條件優(yōu)化及粗提物活性研究

夏 嬙，趙啟鳳，廖 業(yè)，朱 偉，喻國輝，陳遠鳳，宋明英

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)/貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，珠海 519041;2.珠海市農(nóng)業(yè)科學研究中心，珠海 519075)

昆蟲抗菌肽因具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性強、無免疫原性、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性及毒副作用小，對寄主細胞無不良影響等優(yōu)點 (Boman and Hultmark，1987)，成為當今牧畜業(yè)及醫(yī)學研究領域的熱點 (國果等，2012;雷岷等，2012;金小寶等，2012)。

黑水虻Hermetia illucens L.是一種全世界廣泛分布的重要資源昆蟲 (喻國輝等，2009)。其幼蟲生活環(huán)境與家蠅相似，以動物糞便、腐爛的有機物及植物性垃圾為食。研究表明，黑水虻幼蟲取食糞便后不僅可以減少糞便臭氣，還可使雞糞中大腸桿菌和沙門氏菌的量顯著降低 (Erickson et al.，2004)，有效控制奶牛糞便中大腸桿菌ER2566的生長 (Myers et al.，2008)。另外，黑水虻幼蟲還能在體內(nèi)消化多種病原微生物，如霍亂、瘧疾病原物等。黑水虻幼蟲對雞糞中家蠅Musa domestica控制率達到100%，對小家蠅 Fannia canicularis的控制率達到99.9% (Tomberlin and Sheppard，2002)。因而，我們初步推斷黑水虻幼蟲體內(nèi)可能有比家蠅、黃粉蟲等昆蟲更強大的免疫系統(tǒng)才有如此功能。另外，與家蠅等昆蟲相比黑水虻有諸多優(yōu)點適于抗菌肽的研究，如黑水虻成蟲不取食，交配產(chǎn)卵后即死亡 (王付彬等，2010)對環(huán)境無污染、不傳播疾病;化蛹前有遷移特性 (安新城等，2010)可主動移出所飼養(yǎng)環(huán)境;各個發(fā)育階段蟲體均較大，有利于抗菌肽的大量提取。所以，黑水虻是研究抗菌肽的優(yōu)良材料，是藥物研發(fā)的良好素材，但目前國內(nèi)外未見其抗菌肽方面的研究。

本文采用菌液注射誘導法、菌液針刺浸泡誘導法、超聲波誘導法以不同誘導時間及誘導劑量誘導黑水虻幼蟲產(chǎn)生抗菌肽，優(yōu)化黑水虻幼蟲抗菌肽誘導的最佳條件，探討黑水虻抗菌肽提取的最佳方法，為黑水虻抗菌肽的進一步分離純化及活性研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

利用珠海市本地黑水虻資源建立種群，在珠海市農(nóng)業(yè)科學研究中心利用Tomberlin等篩選的紫花苜蓿人工飼料飼養(yǎng)。

1.2 供試用菌種及培養(yǎng)基

菌種:大腸桿菌ATCC8739、金黃色葡萄球菌ATCC6538，購自廣東省微生物菌種保藏中心。

LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，PH=7.4，以蒸餾水定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。

1.3 試劑

硫酸慶大霉素注射液 (80U/2mL)購自廣州白云山天心制藥股份有限公司;滅菌注射用水購自天津藥業(yè)焦作有限公司。

1.4 誘導條件優(yōu)化

1.4.1 誘導齡期優(yōu)化

取2齡、3齡、4齡、5齡、6齡黑水虻幼蟲各200頭，用大腸桿菌菌液 (3×1012個/mL)分別對其進行針刺浸泡誘導，常規(guī)飼養(yǎng)24 h。提取各齡期幼蟲抗菌肽，以大腸桿菌為指示菌測其抑菌活性。每個處理3個重復，以慶大霉素為陽性對照。

1.4.2 誘導條件優(yōu)化

菌液注射誘導:設大腸桿菌、金黃色葡萄球菌2 個菌液注射組，每組設立 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL 4個誘導劑量組;菌液針刺浸泡誘導:設大腸桿菌及金黃色葡萄球菌2個菌液針刺組，每組設立30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、90 s 6個浸泡誘導時間組;超聲波誘導:設40 W、100 W 2個功率誘導組，每組設立5 min、10 min、15 min、20 min、30 min 5個誘導時間組。

每個處理均選取長勢均一黑水虻5齡幼蟲200頭，對其進行誘導，誘導后的幼蟲常規(guī)飼養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h。每個處理3個重復。以未誘導的黑水虻5齡幼蟲為陰性對照，以慶大霉素為陽性對照。

1.5 抗菌肽粗提物提取

取不同誘導處理的黑水虻幼蟲分別稱重、沸水處死、剪碎。用組織研磨器在冰浴中搗碎、勻漿，將提取液與漿液以3∶1混合。將混合物4℃12000 r/min離心2次，每次30 min，取其上清冷凍干燥，配制2 μg/μL粗提物溶液待用。

1.6 抗菌肽粗提物活性測定

滴加20 μL培養(yǎng)24 h大腸桿菌菌液于LB平板，并將其均勻涂布，用滅菌打孔器以等邊三角形打3孔，孔徑均為6 mm。向孔中分別加入不同誘導幼蟲抗菌肽溶液、未誘導幼蟲抗菌肽溶液及慶大霉素溶液各30 μL，待溶液被培養(yǎng)基完全吸收后，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。每個處理3個重復。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

利用 Excel2007、SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析處理;利用SPSS中One－Way ANOVA進行方差分析及多重比較。以平均數(shù)±標準差進行表示。

2 結果與分析

2.1 最佳誘導齡期測定

經(jīng)方差分析及多重比較可知，黑水虻幼蟲誘導后產(chǎn)生抗菌肽活性隨齡期增加而增加，至5齡幼蟲達到最佳抑菌活性，與其他齡期幼蟲產(chǎn)生抗菌肽活性相比差異顯著 (表1)，發(fā)育至6齡時抗菌肽抑菌活性開始降低，但仍顯著高于2齡及3齡幼蟲所產(chǎn)生抗菌肽活性。

表1 不同齡期黑水虻幼蟲所產(chǎn)生抗菌肽對大腸桿菌活性Table 1 Antimicrobial peptides antibacterial activity against E.coli in different instars

2.2 誘導條件優(yōu)化及抑菌活性測定

2.2.1 菌液注射誘導產(chǎn)生抗菌肽粗提物抑菌活性

由圖1、圖2可知，注射10 μL大腸桿菌菌液飼養(yǎng)24 h后產(chǎn)生抗菌肽對大腸桿菌抑菌活性最強，與其他注射組相比有顯著差異 (F:69.000，P＜0.01)，且隨著飼養(yǎng)時間延長及誘導劑量增加抑菌效果呈下降趨勢;金黃色葡萄球菌誘導劑量≤15 μL所產(chǎn)生抗菌肽對大腸桿菌有一定的抑菌活性，但各劑量組間無顯著差異，但隨飼養(yǎng)時間延長有活性降低趨勢。誘導劑量增至20 μL時，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌誘導產(chǎn)生的抗菌肽在各飼養(yǎng)時段對大腸桿菌均無抑菌活性。

2.2.2 菌液針刺浸泡誘導產(chǎn)生抗菌肽粗提物抑菌活性

黑水虻5齡幼蟲浸泡于不同菌液產(chǎn)生抗菌肽活性不同;不同浸泡時間，產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果亦存在差異。由圖3、圖4可知，大腸桿菌菌液針刺浸泡60 s產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最高，與浸泡30 s、40 s、50 s、90 s及金黃色葡萄球菌所有處理組產(chǎn)生抗菌肽活性相比差異顯著 (F:118.4，P＜0.01);且飼養(yǎng)至24 h所提取的抗菌肽抑菌活性最佳。

圖4 大腸桿菌針刺浸泡誘導60 s飼養(yǎng)24 h抗菌肽活性Fig.4 Antimicrobial peptides activity induced by E.coliliquid acupuncture for 60 s，24 h later

2.2.3 超聲波誘導黑水虻幼蟲產(chǎn)生抗菌肽活性

不同功率、不同誘導時間、不同飼養(yǎng)時間黑水虻幼蟲所產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果存在明顯差異(圖5、圖6)。100 W 超聲波誘導黑水虻幼蟲20 min，飼養(yǎng)24 h時產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最高與其他處理組及40 w超聲波誘導組相比差異顯著(F:480.033，P＜0.01)，但幼蟲死亡率有所上升。

圖5 超聲波誘導幼蟲產(chǎn)生抗菌肽活性差異Fig.5 Differences of antimicrobial peptides activity induced by ultrasonic

2.2.4 最佳方法篩選

圖6 100 W超聲波誘導20 min飼養(yǎng)24 h幼蟲抗菌肽活性Fig.6 Antimicrobial peptides activity induced by 100 W ultrasonic，24 h later

由表2可知，與其他處理組相比，大腸桿菌菌液針刺幼蟲后浸泡60 s產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性與100 W超聲波誘導20 min所產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最好，經(jīng)方差分析及多重比較二者間無顯著性差異。但100 W超聲波誘導處理黑水虻幼蟲有死亡現(xiàn)象，因此，大腸桿菌菌液針刺浸泡60 s方法為黑水虻抗菌肽誘導最佳方法。

表2 不同誘導方法誘導黑水虻5齡幼蟲產(chǎn)生抗菌肽活性比較Table 2 Differences of 5thinstar black soldier fly larvae antimicrobial peptides activity induced by different methods

3 結論與討論

不同菌液誘導黑水虻后所產(chǎn)生抗菌肽對大腸桿菌抑菌活性不同，相同菌液不同誘導方法，不同誘導濃度，不同誘導時間所產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性亦不同，誘導后幼蟲飼養(yǎng)時間不同所產(chǎn)生抗菌肽活性也不同。本文中大腸桿菌菌液針刺浸泡誘導60 s及100 W超聲波處理20 min，常規(guī)飼養(yǎng)24 h所產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最強。相同誘導方法及誘導條件下，大腸桿菌菌液誘導黑水虻幼蟲產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果均優(yōu)于金黃色葡萄球菌菌液誘導產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果。這可能是不同誘導源誘導昆蟲所產(chǎn)生的免疫物質(zhì)存在活性差異 (XE Xiansheng et al.，2010)。黑水虻抗菌肽的這一特點與已知昆蟲抗菌肽中富含脯氨酸和富含甘氨酸昆蟲抗菌肽有相似之處 (高琳琳和李衛(wèi)東，2010)，具體屬于哪類抗菌肽還需進一步研究。

不同誘導方法均可使黑水虻幼蟲產(chǎn)生一定的抗菌肽，可見其免疫應答為非專一性的，外界的各種病原體、異物、損傷等均可使其產(chǎn)生免疫應答，而不存在某一特定的抗原物質(zhì)。

不同種類昆蟲對不同誘導源有不同的免疫應答。本文中黑水虻抗菌肽的最佳誘導方法是大腸桿菌菌液針刺浸泡60 s，最佳飼養(yǎng)時間為24 h;黃粉蟲抗菌肽的最佳誘導方法是大腸桿菌菌液注射誘導，最佳飼養(yǎng)時間是48 h(陶淑霞等，2010);斜紋夜蛾抗菌肽的最佳誘導源是大腸桿菌菌液注射誘導，最佳飼養(yǎng)時間是20 h(陳莫林，2006);家蠶抗菌肽的最佳誘導方法是饑餓法 (范濤等，2009)。

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