• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

    2013-04-04 05:43:21鄔萌萌譚曉風(fēng)詹文勇胡孝義
    經(jīng)濟(jì)林研究 2013年2期
    關(guān)鍵詞:油茶開花克隆

    鄔萌萌,譚曉風(fēng) ,周 榮,詹文勇 ,胡孝義

    (1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院,安徽 合肥 230036;2.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410004;3.安徽省油茶良種工程技術(shù)研究中心,安徽 舒城 231340)

    油茶Camellia oleifera是我國(guó)重要的木本油料樹種[1],廣泛分布于我國(guó)南方各省區(qū)[2]。油茶秋季開花,春季果實(shí)才開始膨大,這期間缺少昆蟲等傳粉媒介,這對(duì)其坐果率有一定的影響[3]。因此,改變油茶的花期對(duì)于油茶生產(chǎn)具有重大意義。EMF2(EMBRYONIC FLOWER2)基因是植物抑制開花而維持正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的一個(gè)應(yīng)激基因。當(dāng)EMF2基因的抑制作用解除后,植物才能實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變[4-5]。有關(guān)研究者發(fā)現(xiàn),EMF2基因編碼PcG蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基,該復(fù)合物能引發(fā)許多與開花相關(guān)基因的抑制基因位點(diǎn)的核小體組蛋白H3K27me3(組蛋白H3的N端第27位賴氨酸的3甲基化)水平[6-7]。H3K27me3標(biāo)記由PRC2復(fù)合物引發(fā),被PRC1樣復(fù)合物識(shí)別并維持[8-10],它們的功能缺失都能減弱或消除H3K27me3,導(dǎo)致幼嫩的芽苗也能夠分化出花器官。因此,有關(guān)CoEMF2的研究對(duì)于油茶開花機(jī)理的研究具有重要意義。擬南芥EMF2蛋白正是PRC2復(fù)合物的核心組件[11],而目前有關(guān)油茶EMF2基因的研究尚未見諸報(bào)道。為此,筆者基于茶樹Camellia sinensis EMF2同源基因的一個(gè)片段,采用 3′RACE(RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends) 和 5′RACE技術(shù)對(duì)CoEMF2 基因的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆,同時(shí)對(duì)基因全長(zhǎng)和編碼蛋白進(jìn)行序列分析與理化性質(zhì)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CoEMF2蛋白中含有VEFS-Box結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指蛋白兩個(gè)保守區(qū),這為油茶從芽到開花的誘導(dǎo)的進(jìn)一步研究提出了新思路。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    實(shí)驗(yàn)所用材料為“華鑫”油茶的組織培養(yǎng)幼苗[12],來(lái)自中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

    1.2 方 法

    1.2.1 油茶葉片的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

    采用Invitrogen的總RNA提取Kit(12183-018),并加入CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide上海生工生物工程有限公司),以裂解法提取油茶葉片的總RNA,再用Invitrogen的RACE Kit(18373-019)、(18374-058)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

    1.2.2 特異引物設(shè)計(jì)及RACE擴(kuò)增

    參照茶樹Camellia sinensis EMF2基因的一個(gè)片段,設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE的首輪及巢式特異引物(見表1)。

    表1 特異引物序列Table 1 Sequence of special primers

    PCR反應(yīng)體系(25 μL):5×HS PCR Buffer(Mg+plus)5.0 μL,dDTP Mixture(2.5 mM) 2.0 μL,primer(10 μM)0.5 μL,AUAP(10 μM)0.5 μL,模版 1.0 μL,PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL,滅菌蒸餾水15.75 μL。

    PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,分別在72、70、68 ℃下退火30 s,72 ℃延伸80 s,每個(gè)退火溫度各循環(huán)5次;94 ℃變性30 s,65 ℃下退火30 s,72 ℃延伸80 s,20個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸8 min,4 ℃下保存。

    電泳檢測(cè)巢式PCR結(jié)果,采用Ambiogen公司的Puprep Gel Extraction Kit回收和純化目的條帶,連接于TransGen公司的pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector載體后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),于37 ℃下培養(yǎng),挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),并將含有目的片段的陽(yáng)性克隆送至博尚公司測(cè)序。

    1.2.3 目的基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及分析

    將測(cè)序得到的EMF2基因3′端和5′端序列進(jìn)行拼接,并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì),獲得油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。利用Vector NTI軟件獲得油茶EMF2基因理論上的開放讀碼框,并進(jìn)行氨基酸序列比對(duì);用AnthePro5.0軟件對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);在網(wǎng)址http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl上分析和預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性;采用網(wǎng)址http://www.predictprotein.org/分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);在網(wǎng)址http://cello.life.nctu.edu.tw上進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

    2 結(jié) 果

    2.1 油茶葉片總RNA的提取結(jié)果

    油茶葉片總RNA提取后的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。圖1顯示,28 S與18 S條帶清晰明亮,兩者的總亮度約處于2∶1的狀態(tài)中,符合反轉(zhuǎn)錄和RCAE的實(shí)驗(yàn)要求。

    圖1 油茶葉片總RNA提取結(jié)果Fig.1 Detection of total RNA in C. oleifera leaf

    2.2 目的基因的 3′RACE 與 5′RACE

    3′RACE首輪PCR電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,雖然有兩個(gè)大小不同的條帶,但經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后,檢測(cè)到的僅有單一清晰的條帶,約900 bp,進(jìn)一步進(jìn)行巢式PCR驗(yàn)證,結(jié)果與預(yù)計(jì)的相符(如圖2左所示)。5′RACE產(chǎn)物目的條帶十分明亮,約1 700 bp,如圖2右所示。

    圖2 3′RACE產(chǎn)物與5′RACE產(chǎn)物的電泳圖Fig.2 Electrophoresis distribution of 3′RACE and 5′RACE products

    2.3 CoEMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列分析

    3′RACE 和 5′RACE 測(cè) 序 得 到 892 和 1 801 bp的片段,將二者進(jìn)行拼接,獲得序列2 210 bp(如圖3所示,圖3的方框?yàn)槠鹗己徒K止密碼子,下劃線為PolyA尾),包含1個(gè)完整的1 866 bp CDS 及 37 bp 5′UTR 和 307 bp 3′UTR,編碼621個(gè)氨基酸。將其與其它物種EMF2氨基酸序列進(jìn)行在線比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn),其與茶樹、葡萄、毛果楊的同源性分別高達(dá)97%、80%、81%。因此推測(cè),該序列為油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

    通過(guò)NCBI在線比對(duì)后發(fā)現(xiàn),油茶EMF2蛋白含有一個(gè)高度保守的VEFS-Box家族區(qū)域(如圖4所示)。其中VEFS是VRN2-EMF2-FIS2-Su(z)12的簡(jiǎn)稱,VRN2(VERNALIZATION2)為春化作用相關(guān)基因[13]、FIS2(FERTILIZATION INDEPENDENT SEEDS2)是胚乳發(fā)育相關(guān)基因[14]、Su(z)12是染色質(zhì)表達(dá)及精細(xì)胞形成的相關(guān)基因[15]。

    與其它植物該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)樹分析,結(jié)果如圖5所示。圖5表明,油茶與茶樹EMF2的親緣關(guān)系最接近,在氨基酸序列和保守元件VEFS-Box上也極為相似。根據(jù)上述分析結(jié)果可以初步斷定,所獲得的序列為油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并命之名為CoEMF2。

    圖3 油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNAFig.3 Full-length cDNA sequence of C.oleifera EMF2 gene

    圖4 油茶EMF2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domains in C. oleifera EMF2 protein

    圖5 油茶與其它物種EMF2的親緣進(jìn)化關(guān)系Fig.5 Phylegenetic tree of EMF2 in C. oleifera and other species

    2.4 理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

    借助在線軟件分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì):CoEMF2的ORF編碼621個(gè)氨基酸,分子量為70.54 KD;等電點(diǎn)為6.17,其中負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)的數(shù)目為78,正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)的數(shù)目為70;分子式可寫成C3108H4875N867O936S37;不穩(wěn)定系數(shù)為53.04,屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

    疏水性的分析結(jié)果如圖6所示。圖6表明,CoEMF2蛋白的疏水指數(shù)從-2.733到2.978(橫坐標(biāo)為氨基酸順序,縱坐標(biāo)為親、疏水值;“-”表示親水性,“+”表示疏水性),疏水區(qū)大于親水區(qū),因此推測(cè),CoEMF2為疏水性蛋白。該蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)域:分別位于N端的137~153位,方向由外向內(nèi);C端的573~591位,跨膜方向由內(nèi)向外(如圖7所示)。

    圖6 油茶EMF2蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果Fig.6 Hydrophobicity analysis of C. oleifera EMF2 protein

    圖7 油茶EMF2蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Prediction on membrane-spanning region in C. oleifera EMF2 protein

    卷曲螺旋預(yù)測(cè)結(jié)果表明,CoEMF2蛋白質(zhì)中可能存在8個(gè)較為明顯的螺旋結(jié)構(gòu)。Predictprotein軟件預(yù)測(cè)的CoEMF2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖8所示。圖8中,H表示α螺旋,E表示β折疊,L表示無(wú)規(guī)則卷曲。該蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)為21.74%,β折疊10.95%,無(wú)規(guī)則卷曲及其它結(jié)構(gòu)67.31%。CoEMF2蛋白的312-333位氨基酸處存在一個(gè)C2H2型鋅指蛋白(Zinc finger protein),該蛋白依靠其指型空間結(jié)構(gòu)伸入到DNA雙螺旋的大溝內(nèi),通過(guò)α螺旋與DNA的堿基形成特異性接觸[16],有助于PRC2復(fù)合體結(jié)合到染色質(zhì)上,進(jìn)而對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記修飾。

    2.5 亞細(xì)胞定位和修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

    在http://cello.life.nctu.edu.tw網(wǎng)址上對(duì)CoEMF2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果見表2。由表2可知,其位于細(xì)胞核中的可靠性最高。運(yùn)用KinasePhos軟件在線對(duì)CoEMF2蛋白序列修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明了含有55個(gè)絲氨酸激酶、25個(gè)蘇氨酸激酶、15個(gè)酪氨酸激酶潛在磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)組氨酸磷酸化位點(diǎn),這說(shuō)明該蛋白被磷酸化修飾的可能性很大。

    圖8 油茶EMF2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 Secondary structure predictions in C. oleifera EMF2 protein

    表2 油茶CoEMF2基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Prediction on subcellular localization in C. oleifera CoEMF2

    3 結(jié)論與討論

    本研究克隆了CoEMF2基因,并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了分析,結(jié)果表明:開放閱讀框?yàn)? 866 bp,編碼621個(gè)氨基酸,蛋白分子量為70.54 kD,其為不穩(wěn)定的疏水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明,CoEMF2位于細(xì)胞核中,這與CoEMF2對(duì)于染色質(zhì)進(jìn)行H3K27me3的功能執(zhí)行是相一致的。

    實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),CoEMF2蛋白中含有兩個(gè)保守區(qū):VEFS-Box結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指蛋白。CoEMF2蛋白具有VEFS-Box家族基因的保守域結(jié)構(gòu)特征:通過(guò)抑制AP1(APETALA1)、CAL(CAULIFLOWER)、FUL(FRUITFULL)等基因的作用從而抑制植物開花[17-18]。同時(shí),VEFS-Box結(jié)構(gòu)域很可能結(jié)合鋅指蛋白一起參與到油茶開花的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程中。由于CoEMF2基因在結(jié)構(gòu)和功能上與Su(z)12基因相似,編碼PcG蛋白復(fù)合體,而PcG蛋白復(fù)合體的下游靶基因中,有開花同源基因AG(AGAMOUS)、AP3(APETALA3)和PI(PISTILLATA)[19-20],所以推測(cè),CoEMF2也會(huì)通過(guò)對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記修飾(例如H3K27me3)來(lái)實(shí)施對(duì)這些下游基因表達(dá)的調(diào)控,進(jìn)而控制營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化[21]。

    CoEMF2參與組成的PRC2復(fù)合物催化H3K27me3的形成,并抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。若能在體細(xì)胞胚培養(yǎng)過(guò)程中減弱或消除H3K27me3標(biāo)記,就可能會(huì)增強(qiáng)胚性基因的表達(dá),從而提高脂肪酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平[22-23]。因此,本研究不僅為今后有關(guān)油茶從芽到開花的誘導(dǎo)問(wèn)題的進(jìn)一步研究提出了新的思路,也為研究油茶愈傷組織的成脂效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 劉 凱,譚曉風(fēng),龍洪旭,等.油茶DGATl基因的全長(zhǎng)cDNA序列克隆及分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,32(4): 148 - 152.

    [2] 中南林學(xué)院.經(jīng)濟(jì)林栽培[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1983:127-135.

    [3] 胡孝義.油茶種子活性氧相關(guān)基因的克隆及樹體RNA干擾技術(shù)研究[D].長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué), 2009.

    [4] 齊飛艷,陳媛文,張 穎,等.毛竹EMF2類基因原核表達(dá)條件優(yōu)化[J].分子植物育種,2012, 10(4):485-489.

    [5] 胡 波.茶樹成花相關(guān)基因的cDNA克隆及生物信息學(xué)分析[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2010.

    [6] Holec S, F B. Polycomb group complexes mediate developmental transitions in plants[J]. Plant Physiology, 2012,158:35 - 43.

    [7] Schwartz YB, V P. Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes[J]. Nature Reviews Genetics, 2007, 8(1):9 - 22.

    [8] Lafos M, Kroll P, Hohenstatt ML,et al. Dynamic Regulation of H3K27 Trimethylation duringArabidopsisDifferentiation[J].Plos Genetics, 2011,7(4):134 - 139.

    [9] Zheng BL, XM C. Dynamics of histone H3 lysine 27 trimethylation in plant development[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2011, 14(2):123 - 129.

    [10] Chanvivattana Y, Bishopp A, Schubert D,et al.Interaction of Polycomb-group proteins controlling flowering inArabidopsis[J].Development, 2004,131:5263 - 5276.

    [11] Bouyer D, Roudier F, Heese M,et al. Polycomb Repressive Complex 2 Controls the Embryo-to-Seedling Phase Transition[J].Plos Genetics, 2011,7(3):1 - 19.

    [12] 范曉明.油茶組織培養(yǎng)技術(shù)研究[D].長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2011.

    [13] Wood CC, Robertson M, Tanner G,et al. TheArabidopsis thalianavernalization response requires a polycomb-like protein complex that also includes VERNALIZATION INSENSITIVE 3[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006,103(39):14631 - 14636.

    [14] Luo M, Bilodeau P, Koltunow A,et al.Genes controlling fertilization-independent seed development inArabidopsis thaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(1): 196 - 301.

    [15] Pasini D, Bracken AP, Hansen JB,et al.The polycomb group protein Suz12 is required for embryonic stem cell differentiation[J]. Molecular and Cellular Biology, 2007, 27(10):3769-3779.

    [16] 黃 驥,王建飛,張紅生.植物C2H2型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 [J]. HEREDITAS,2004,26(3): 414 - 418.

    [17] Chen L J, Diao Z Y, Specht C,et al.Molecular evolution of VEF-domain-containing PcG genes in plants[J]. Plant and Cell Physiology, 2009, 2:738 - 754.

    [18] Pien S, U G, Polycomb group and trithorax group proteins inArabidopsis[J]. Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression, 2008, 1769(5 - 6):375 - 382.

    [19] Moon Y H, Chen L J, Pan R L,et al. EMF genes maintain vegetative development by repressing the flower program inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2003, 15:681 - 693.

    [20] Meunier J, Khelifi A, Navratil V,et al.Homology-dependent methylation in primate repetitive DNA[J]. Pro Natl Acad Sci USA, 2005, 102: 5471 - 5476.

    [21] Calonje M, R SZ. Complexity beneath the silence [J]. Curr Opin Plant Biol, 2006:530 - 537.

    [22] Jiang DH, Wang YQ, Wang YZ,et al. Repression of FLOWERING LOCUS C and FLOWERING LOCUS T by theArabidopsisPolycomb Repressive Complex 2 Components[J].Plos One, 2008, 3(10):163 - 168.

    [23] 譚曉風(fēng),張黨權(quán),陳鴻鵬,等.油茶查爾酮合酶和異構(gòu)酶基因的cDNA克隆[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(1):9-13.

    猜你喜歡
    油茶開花克隆
    克隆狼
    浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
    《一棵開花的樹》
    金橋(2019年12期)2019-08-13 07:16:40
    雨開花
    文苑(2019年14期)2019-08-09 02:14:06
    一雙開花的舊靴
    大灰狼(2019年5期)2019-05-29 17:45:26
    油茶芽苗嫁接育苗技術(shù)
    高產(chǎn)油茶的整形修剪技術(shù)
    永勝油茶的深情厚意
    “四化”舉措做大做強(qiáng)油茶產(chǎn)業(yè)
    国产精品亚洲美女久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品一区二区三区四区五区乱码| 69av精品久久久久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产av在哪里看| 久久香蕉精品热| 韩国av一区二区三区四区| 久久伊人香网站| 午夜老司机福利片| 黄片大片在线免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产午夜精品久久久久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲成人中文字幕在线播放| 成人国产一区最新在线观看| 身体一侧抽搐| 哪里可以看免费的av片| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 高清在线国产一区| 校园春色视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 色播亚洲综合网| 中文字幕高清在线视频| cao死你这个sao货| 在线免费观看的www视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产高清激情床上av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | av免费在线观看网站| 色老头精品视频在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一级毛片高清免费大全| 男女那种视频在线观看| 日本三级黄在线观看| av片东京热男人的天堂| 亚洲人成电影免费在线| 午夜福利视频1000在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费在线观看完整版高清| 亚洲专区中文字幕在线| 99国产精品一区二区三区| 中文字幕久久专区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 美女扒开内裤让男人捅视频| 校园春色视频在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲人成电影免费在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产高清videossex| 最近在线观看免费完整版| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲熟妇熟女久久| 国产91精品成人一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品久久久久久,| 亚洲成人精品中文字幕电影| 嫩草影视91久久| 国产99白浆流出| 女同久久另类99精品国产91| 欧美激情久久久久久爽电影| 一本综合久久免费| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲国产欧美网| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久久久久久免费视频了| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品电影一区二区三区| 成人18禁在线播放| 国产成人欧美在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 国产av不卡久久| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久国产欧美日韩av| 午夜免费成人在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 成人欧美大片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美乱妇无乱码| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产私拍福利视频在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 不卡一级毛片| 亚洲电影在线观看av| 欧美乱色亚洲激情| 中文字幕久久专区| 精品一区二区三区av网在线观看| 成人三级做爰电影| 国产成人欧美在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 色综合站精品国产| 舔av片在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 动漫黄色视频在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 91九色精品人成在线观看| 久久 成人 亚洲| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品欧美一区二区三区在线| 国产黄色小视频在线观看| 悠悠久久av| av天堂在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩欧美精品v在线| 亚洲国产看品久久| 色综合婷婷激情| 怎么达到女性高潮| 9191精品国产免费久久| 91九色精品人成在线观看| av免费在线观看网站| 免费在线观看影片大全网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 看免费av毛片| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产午夜精品论理片| 婷婷亚洲欧美| 妹子高潮喷水视频| bbb黄色大片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| svipshipincom国产片| 国内精品久久久久精免费| 中文字幕高清在线视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 小说图片视频综合网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一a级毛片在线观看| 国产成年人精品一区二区| 哪里可以看免费的av片| 大型av网站在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久性生活片| 精品久久久久久久久久久久久| 男女那种视频在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 一级毛片高清免费大全| 成年版毛片免费区| 老汉色∧v一级毛片| 色在线成人网| 国产精品免费一区二区三区在线| a级毛片a级免费在线| 中亚洲国语对白在线视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 色综合欧美亚洲国产小说| 两个人看的免费小视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 日韩免费av在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 床上黄色一级片| 免费搜索国产男女视频| 免费在线观看黄色视频的| 99热这里只有精品一区 | a在线观看视频网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线播放国产精品三级| 男男h啪啪无遮挡| av免费在线观看网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99久久精品热视频| 天天添夜夜摸| 国产成人精品无人区| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产av麻豆久久久久久久| www日本在线高清视频| 一区二区三区高清视频在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 男女床上黄色一级片免费看| 制服丝袜大香蕉在线| 国产av又大| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av成人精品一区久久| 真人做人爱边吃奶动态| 久久香蕉精品热| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久久大精品| 久久精品成人免费网站| 无人区码免费观看不卡| 伦理电影免费视频| 亚洲专区字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 香蕉av资源在线| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美日韩福利视频一区二区| 一本精品99久久精品77| 看免费av毛片| www日本在线高清视频| 91字幕亚洲| av欧美777| 亚洲国产欧美人成| 一本久久中文字幕| 免费看日本二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 91在线观看av| 悠悠久久av| 88av欧美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线看三级毛片| 色av中文字幕| 日本三级黄在线观看| 国产久久久一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲专区国产一区二区| 午夜免费成人在线视频| 草草在线视频免费看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美乱色亚洲激情| av天堂在线播放| 久久久久久久午夜电影| 国产成人影院久久av| 欧美极品一区二区三区四区| 国产成人精品久久二区二区免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美在线黄色| av在线天堂中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av中文乱码字幕在线| 亚洲国产欧美人成| 香蕉国产在线看| 天堂影院成人在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 成人三级黄色视频| 久久久国产精品麻豆| 真人一进一出gif抽搐免费| 制服人妻中文乱码| 国产亚洲av高清不卡| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产亚洲欧美在线一区二区| 1024手机看黄色片| 级片在线观看| 国产免费男女视频| 国产一区二区三区视频了| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美日韩乱码在线| 首页视频小说图片口味搜索| 国产激情偷乱视频一区二区| 悠悠久久av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人精品久久二区二区91| av片东京热男人的天堂| 免费观看精品视频网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av成人av| 亚洲人成电影免费在线| 久久久久久久久中文| 日韩免费av在线播放| 亚洲国产欧美人成| 国产麻豆成人av免费视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精华霜和精华液先用哪个| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲男人的天堂狠狠| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线视频色国产色| 最近视频中文字幕2019在线8| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久热在线av| 婷婷亚洲欧美| 午夜a级毛片| 国产成人精品无人区| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久人人精品亚洲av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久香蕉激情| 成人欧美大片| 午夜福利在线在线| 国产一区二区激情短视频| 久久久久九九精品影院| xxx96com| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久久久国产a免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 成年女人毛片免费观看观看9| 男男h啪啪无遮挡| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲,欧美精品.| 午夜精品在线福利| 国内精品久久久久精免费| 波多野结衣高清无吗| 丝袜美腿诱惑在线| 老司机福利观看| 在线a可以看的网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | www.999成人在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 成人欧美大片| 精品久久久久久,| 国模一区二区三区四区视频 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品在线美女| 变态另类丝袜制服| 在线看三级毛片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品 国内视频| 精品久久久久久久久久久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产av不卡久久| 国产成人aa在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 无遮挡黄片免费观看| 禁无遮挡网站| 人人妻人人看人人澡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日本黄大片高清| 一个人免费在线观看的高清视频| www国产在线视频色| 在线a可以看的网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av片东京热男人的天堂| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 美女黄网站色视频| 99在线视频只有这里精品首页| 国产亚洲精品av在线| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日本在线视频免费播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 听说在线观看完整版免费高清| 色综合欧美亚洲国产小说| 妹子高潮喷水视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线a可以看的网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产区一区二久久| 国产黄片美女视频| 日韩三级视频一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 美女免费视频网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线国产一区二区在线| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲欧美日韩高清专用| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产欧美日韩一区二区三| 国产成人aa在线观看| 手机成人av网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲av五月六月丁香网| 免费在线观看完整版高清| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 波多野结衣高清作品| 在线看三级毛片| 在线观看66精品国产| av有码第一页| 精品久久蜜臀av无| 久久久久久九九精品二区国产 | 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久久久久精品电影| 很黄的视频免费| 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成人亚洲精品av一区二区| 老司机靠b影院| 丝袜美腿诱惑在线| 久久热在线av| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久性视频一级片| 国产午夜精品论理片| 草草在线视频免费看| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久久久久中文| 岛国视频午夜一区免费看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 老鸭窝网址在线观看| 久久精品国产综合久久久| 久久久久久久久久黄片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一区二区三区激情视频| videosex国产| 亚洲国产精品久久男人天堂| 97碰自拍视频| 久久亚洲真实| 一区二区三区国产精品乱码| 久久99热这里只有精品18| 最近在线观看免费完整版| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 俺也久久电影网| 人人妻人人看人人澡| 亚洲成人国产一区在线观看| 性欧美人与动物交配| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产高清videossex| av天堂在线播放| 久9热在线精品视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 嫩草影院精品99| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 很黄的视频免费| 我的老师免费观看完整版| 亚洲五月天丁香| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲18禁久久av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 无遮挡黄片免费观看| 久9热在线精品视频| 黄色成人免费大全| 丝袜美腿诱惑在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 1024香蕉在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜福利高清视频| 俺也久久电影网| 午夜激情av网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 一区福利在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| 久久精品91无色码中文字幕| 黑人操中国人逼视频| 哪里可以看免费的av片| 久久久久久人人人人人| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人18禁在线播放| 国产欧美日韩一区二区三| 天堂影院成人在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本在线视频免费播放| avwww免费| 亚洲avbb在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 天堂影院成人在线观看| 亚洲美女视频黄频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品久久久久久,| 成人国语在线视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美一级毛片孕妇| 成人三级黄色视频| av片东京热男人的天堂| 午夜福利18| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲专区字幕在线| АⅤ资源中文在线天堂| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲成人中文字幕在线播放| 在线观看免费日韩欧美大片| 成人国产综合亚洲| av在线天堂中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av成人精品一区久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美成人免费av一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 色av中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品永久免费网站| 国产高清激情床上av| 国产成人啪精品午夜网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲第一电影网av| 丰满的人妻完整版| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲激情在线av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久天堂一区二区三区四区| 日本在线视频免费播放| 国产主播在线观看一区二区| 中出人妻视频一区二区| 午夜福利高清视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美一区二区精品小视频在线| 最近在线观看免费完整版| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆国产av国片精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产99白浆流出| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜福利高清视频| 国产成人av教育| 国产av在哪里看| 欧美3d第一页| 村上凉子中文字幕在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 草草在线视频免费看| 级片在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产探花在线观看一区二区| 天堂√8在线中文| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品影院6| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲av成人av| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 麻豆一二三区av精品| 九九热线精品视视频播放| netflix在线观看网站| 亚洲av电影在线进入| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99国产综合亚洲精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美黑人巨大hd| 久久香蕉精品热| 1024手机看黄色片| 亚洲专区中文字幕在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日本五十路高清| 首页视频小说图片口味搜索| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人18禁在线播放| 亚洲精品色激情综合| 欧美最黄视频在线播放免费| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲国产精品成人综合色| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产熟女午夜一区二区三区| 色噜噜av男人的天堂激情| 麻豆一二三区av精品| 免费看十八禁软件| 无遮挡黄片免费观看| 国内精品久久久久精免费| 欧美在线一区亚洲| 18禁观看日本| 亚洲天堂国产精品一区在线| 丝袜美腿诱惑在线| 我的老师免费观看完整版| 国产激情久久老熟女| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲成人久久爱视频| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久性视频一级片| 国产不卡一卡二| 可以在线观看毛片的网站| 1024视频免费在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久久精品大字幕| 国产精品 国内视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美又色又爽又黄视频| 中文在线观看免费www的网站 | 日本黄色视频三级网站网址| 精品日产1卡2卡| 国产精品九九99| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品九九99| 熟女电影av网| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久久久电影 | 国产麻豆成人av免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 超碰成人久久| 在线观看日韩欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 特级一级黄色大片| 无人区码免费观看不卡|