家蠶抗藥性的研究現(xiàn)狀及其思考

蔡自崢，陸喦，柳新菊，繆云根

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑所，浙江杭州 310021）

家蠶抗藥性的研究現(xiàn)狀及其思考

蔡自崢1，陸喦1，柳新菊2，繆云根2

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑所，浙江杭州 310021）

環(huán)境污染和化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用是影響農(nóng)業(yè)生境的主要因素。家蠶由于長期的人工馴化和飼養(yǎng)，對農(nóng)藥和環(huán)境抗逆性差，可能成為抗藥性和環(huán)境脅迫研究的指示生物，也是研究鱗翅目昆蟲抗藥性的理想生物之一。本文介紹了與抗藥性相關(guān)的基因及主要解毒酶系；家蠶解毒酶系的表達特性及相關(guān)基因的克隆與功能研究現(xiàn)狀。

家蠶；農(nóng)藥抗藥性；解毒酶系；生物指標(biāo)

環(huán)境污染和化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的主要因素。家蠶（Bombyx mori）起源于野桑蠶（Bombyx mandarina），屬昆蟲綱鱗翅目蠶蛾科，以桑葉為食料的吐絲結(jié)繭的經(jīng)濟昆蟲之一。由于長期的自然選擇和農(nóng)藥的壓力選擇，家蠶和野桑蠶對不良環(huán)境和農(nóng)藥的抵抗能力存在很大的差異。與野桑蠶相比，家蠶對有機磷和菊酯類農(nóng)藥更加敏感，對農(nóng)藥和環(huán)境抗逆性差［1，2］。家蠶對環(huán)境污染的敏感性對一些新的化學(xué)藥品進行高濃度急性和低濃度慢性生物毒性試驗可以有效地評價這些化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險，可能成為抗藥性和環(huán)境脅迫研究的指示生物，也是研究鱗翅目昆蟲抗藥性的理想生物之一。

1 家蠶作為研究昆蟲抗藥性的生物指標(biāo)

家蠶作為鱗翅目昆蟲的典型代表和理想的生物學(xué)模型對動物科學(xué)的發(fā)展起到了巨大的推動作用。相對于其他模式生物，家蠶還具有獨特的優(yōu)勢：一是家蠶遺傳資源十分豐富，具有大量形態(tài)突變和遺傳致死及生理缺陷系統(tǒng)，其中胚胎和幼蟲期突變尤為豐富；二是家蠶具有悠久的基礎(chǔ)研究歷史和現(xiàn)代科學(xué)研究基礎(chǔ)，特別是目前已擁有詳細的基因組生物信息支撐，并建有轉(zhuǎn)基因等關(guān)鍵技術(shù)平臺；三是家蠶重測序成果，為深入研究家蠶重要性狀和進化歷程提供了極為豐富的信息；四是家蠶作為重要的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟昆蟲，眾多數(shù)量遺傳性狀被系統(tǒng)深入地研究，家蠶的生理、病理、生化基礎(chǔ)等也已被廣泛深入地研究，其理論背景明確，并實現(xiàn)了人為控制發(fā)育。

家蠶對有害物質(zhì)和以害蟲為靶標(biāo)的農(nóng)藥十分敏感。日本學(xué)者增井博之［3］利用無菌飼養(yǎng)的不同發(fā)育階段家蠶進行重金屬的毒性檢測，通過測定半數(shù)致死劑量（LD50）觀測蠶的變態(tài)、結(jié)繭和羽化過程等，對單一或混合重金屬引起的毒性反應(yīng)進行了分析，并對家蠶后代體內(nèi)微量殘留的重金屬進行了檢測。有研究，將殺滅天牛的有機磷農(nóng)藥MEP乳劑配制成低濃度藥液（稀釋至50000倍）后給家蠶幼蟲添食，仍可觀察到典型的中毒癥狀［4］。

2 與抗藥性相關(guān)的主要酶及基因

昆蟲的抗藥性機制可分為靶標(biāo)抗性和代謝抗性兩種。靶標(biāo)抗性是位點突變，而代謝抗性改變解毒蛋白水平或活性，它們單獨或聯(lián)合作用都可改變其抗性水平，有時會達到高抗，甚至對多類殺蟲劑產(chǎn)生抗性［5］。大量研究表明，殺蟲劑作用靶標(biāo)的基因突變導(dǎo)致敏感性下降是害蟲抗藥性形成的重要機制，但還沒有真正闡明其內(nèi)在的機理和提出應(yīng)對的策略。而且大多數(shù)研究集中在果蠅、家蠅和尖音庫蚊這些病原傳媒害蟲以及棉蚜、棉鈴蟲、桃蚜等農(nóng)業(yè)害蟲中。

昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)是昆蟲體內(nèi)最為重要的生理系統(tǒng)之一。它在昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)調(diào)節(jié)以及各種行為等方面都發(fā)揮重要的作用，例如昆蟲變態(tài)發(fā)育過程就是由神經(jīng)系統(tǒng)激素調(diào)控的復(fù)雜生理過程。因此，殺蟲劑作用靶點都集中于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，作為殺蟲劑靶點的主要有乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）、乙酰膽堿受體（Acetylcholine receptor，AChR）、鈉離子通道（Sodium channel）、GABA門控氯離子通道（GABA-gated chlorine channel）和激素調(diào)控系統(tǒng)蛻皮激素信號通路（Ecdysone hormone network）等。通過對靶點基因的研究，可以實現(xiàn)在基因水平闡釋殺蟲劑作用機理以及昆蟲抗藥性產(chǎn)生的分子機理。因此了解神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能以及殺蟲劑對神經(jīng)靶點作用機制，是分析昆蟲行為、藥劑作用機理和研制新藥劑的理論基礎(chǔ)。

代謝抗性機制主要是通過解毒代謝酶基因擴增或過量表達，導(dǎo)致解毒代謝調(diào)節(jié)酶的活性顯著升高，解毒代謝能力增強而對殺蟲劑形成抗性。涉及代謝抗性解毒酶主要有細胞乙酰膽堿酯酶（AchE）、色素P450、非專一性酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等。在這些酶中只要有一個酶的組成部分發(fā)生改變就可能改變對殺蟲劑的解毒作用，但往往是聯(lián)合發(fā)生作用。

乙酰膽堿酯酶（AchE）是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的靶標(biāo)。由于這2類藥劑的廣泛使用，目前已經(jīng)有60種以上的昆蟲對此靶標(biāo)產(chǎn)生抗藥性［6］。昆蟲抗藥性在分子水平上主要有2種機制，即基因突變和基因擴增。許多害蟲的AchE基因發(fā)生突變與抗藥性產(chǎn)生有密切關(guān)系，昆蟲的AchE基因發(fā)生突變，其產(chǎn)物AchE發(fā)生變構(gòu)，使得其對殺蟲劑的敏感性降低，從而使昆蟲產(chǎn)生抗藥性。也有研究認為，抗性與AchE蛋白多態(tài)性的丟失相關(guān)［7，8］。

細胞色素P450是昆蟲體內(nèi)參與種類殺蟲劑和其它內(nèi)、外源化合物代謝的主要解毒酶系，在生物體內(nèi)氧化代謝中起著關(guān)鍵的作用。它與氧分子和底物結(jié)合，決定著整個系統(tǒng)的底物專一性，并參與氧的活化。相關(guān)的P450基因表達及催化活動發(fā)生變化，被認為是昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要機制之一。P450基因足一個超級家族，當(dāng)前已知該超基因家族包括36個基因族［9］。在昆蟲中已克隆了4個基因家族，分屬于Cy、Cy、C'，JP9和CYP18家族，其中屬于C'，家族的Cy，CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B1和CYP6D1等基因已被證實或推測與昆蟲抗藥性有關(guān)［10］。對菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的果蠅和其它害蟲與Cy基因的過量表達有關(guān)［5］。

除此之外，非專一性酯酶（ESTs）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）也相繼被發(fā)現(xiàn)是是昆蟲體內(nèi)殺蟲劑的主要解毒酶。

從目前研究來看，靶標(biāo)抗性的AchE、SC及GABA受體一般都與結(jié)構(gòu)基因的點突變有關(guān)。而代謝抗性與相關(guān)的P450基因增強表達有關(guān)，與ESTs基因突變、基因擴增及轉(zhuǎn)錄有關(guān)，并與GST基因擴增及調(diào)節(jié)有關(guān)。

3 家蠶解毒酶系的表達特性及相關(guān)基因的克隆與功能研究現(xiàn)狀

家蠶存在兩種乙酰膽堿酯酶基因，即乙酰膽堿酯酶1（Bm-acel）與乙酰膽堿酯酶2（Bm-ace2）。其中Bm-acel基因全長3851bp，含有2個內(nèi)含子，基因編碼區(qū)全長2052bp，編碼約683個氨基酸殘基。Bm-ace2基因全長2700bp，約含5個內(nèi)含子，編碼區(qū)長為1917bp，編碼一個638個殘基的氨基酸，預(yù)測含有一個約23個氨基酸殘基的信號肽。

在家蠶發(fā)育的各個時期Bm-ace1的表達量均高于Bm-ace2。他們都表現(xiàn)出先下降后上升的總體趨勢，其中Bm-ace1在3齡家蠶的表達量達到最低，而Bm-ace2在2齡期家蠶最低。Bm-ace1和Bm-ace2表達量都在家蠶的腦部和脂肪體相對于其他組織要高，Bm-ace1在中腸有少量表達，而Bm-ace2在絲腺中少量表達。

Seino（2007）等對家蠶兩種類型ace基因的cDNA進行了克隆分析［11］。Shang（2007）等在真核細胞內(nèi)表達了家蠶的Bm-ace1、Bm-ace2，結(jié)果表明，Bmace2的真核表達產(chǎn)物對有機磷農(nóng)藥較敏感［12］。

細胞色素P450對昆蟲的生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性以及抗藥性具有至關(guān)重要的作用。P450蛋白種類的多樣性及其底物的重疊性使P450酶系可以催化生物體內(nèi)多種類型的反應(yīng)，不僅對許多外來物質(zhì)如殺蟲劑及其它環(huán)境有毒物質(zhì)具有代謝作用，還參與一些起主要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)如激素、脂肪酸的代謝［13］。

在昆蟲中已報道28個細胞色素P450基因家族和數(shù)百個細胞色素P450基因。其中可能與抗藥性相關(guān)的基因主要集中在CYP6和CYP9家族，家蠶CYP9A22基因包含9個內(nèi)含子，長度分別為1028、384、208、279、1410、2722、702、1216、1377 bp，其兩端符合GT-AG規(guī)則［14］。家蠅（Musca domestica）對有機磷抗藥性相關(guān)的基因為CYP6A-l［15，16］、對擬除蟲菊酯抗藥性相關(guān)的CYP6D1［17，18］，果蠅對DDT抗藥性相關(guān)的CYP6G1［19］，煙芽夜蛾對擬除蟲菊酯抗藥性相關(guān)的基因CYP9A1［20，21］等。因此，一個或幾個P450基因過量表達引起P450解毒酶量的增加是導(dǎo)致昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一［22，23］。

在氯氰菊酯誘導(dǎo)的誘導(dǎo)作用下，對5齡家蠶幼蟲的中腸和脂肪體，采用半定量RT-PCR方法檢測其中各CYP9A22基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。實驗結(jié)果表明，在未進行氯氰菊酯誘導(dǎo)的作用下，CYP9A22在中腸中的表達量遠高于脂肪體中，在未進行氯氰菊酯誘導(dǎo)的作用下，CYP9A22基因在中腸中的表達量相近，在脂肪體中有明顯差異。

研究表明，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）是由多基因編碼的蛋白質(zhì)，主要功能是催化谷胱甘肽（glutalhione，GSH）的巰基與一些親電子類有毒物質(zhì)（如殺蟲劑、醌類化合物及過氧化物等）進行軛合反應(yīng)（conjugation reaction），從而保護DNA及一些蛋白質(zhì)免受損傷［24］。

根據(jù)在細胞中的定位，可以將GST分為微粒體型、線粒體型和胞質(zhì)型三大類型。胞質(zhì)GST的數(shù)量繁多，且與昆蟲的抗藥性密切相關(guān)，因此得科學(xué)工作者的廣泛研究。家蠶23個胞質(zhì)GST中有GSTd4、GSTe7和GSTe8這3個基因的CDS區(qū)預(yù)測還不完整，其中有19個GST基因已經(jīng)有相應(yīng)的表達證據(jù)。家蠶中Delta家族有4個基因，除不完整的GSTd4外，其他基因的氨基酸序列的一致性為43.2～61.8%［25］。2010年，趙國棟等［26］選擇家蠶GST基因從分子水平上研究家蠶體內(nèi)的解毒機制和抗性機制，以實時熒光定量PCR的方法分別檢測了BmGSTdl基因在正常飼養(yǎng)及添食NaF的情況下家蠶5齡幼蟲不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果證實添食NaF后中腸和脂肪體中BmGSTdl基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，可能是由于這2種組織是家蠶的主要解毒器官。余泉友［25］等在家蠶基因組中共鑒定出8個Epsilon家族的基因，其中BmGSTe3與小菜蛾中有機磷抗性相關(guān)基因中的PxGST3有著近52.7%的氨基酸序列一致性，在進化上距離較近，可能為其直系同源基因。許湲［27］和劉佳［28］分別于2008年和2009年克隆并表達了家蠶BmGSTe3和BmGSTe4基因，并對表達產(chǎn)物進行了真核表達，研究結(jié)果表明BmGSTe3基因的表達具有較高的組織特異性，只能在血淋巴和頭部中有表達，而BmGSTe4只在表皮和頭部中表達。余泉友等［25］以按蚊等昆蟲的微粒體GST與家蠶基因組比對后分析表明，家蠶有兩個微粒體GST基因，命名為BmGSTmic1和BmGSTmic2，家蠶這兩個微粒體GST基因具有高度的保守性，其氨基酸一致性高達65.3℉。2007年，侯成香等［29］研究了家蠶GST活性的組織分布以及發(fā)育階段的變化規(guī)律及不同類型中家蠶品種間GST的活性差異，結(jié)果表明在5齡期家蠶幼蟲的脂肪體、中腸、血淋巴、表皮和頭部都檢測到了GST，其中在脂肪體和中腸中GST活性較其他組織中的高出很多。

近年來，昆蟲的抗藥性日益嚴重，造成大量的藥物殘留，給人們的人身安全帶來了不可估量的危害。家蠶作為一種模式生物，其對環(huán)境污染和對一些新的化學(xué)藥品的敏感性研究，可能成為抗藥性和環(huán)境脅迫研究的指示生物。

［1］沈衛(wèi)德，李兵，季平，等.野桑蠶和家蠶的環(huán)境適應(yīng)性比較研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2003，29（4）：375～379.

［2］趙華強，王東，李兵，等.殺蟲劑溴氰菊酯對野桑蠶和家蠶的毒力比較［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2008，34（1）：115～119.

［3］增井博之.重金屬對無菌蠶的影響-當(dāng)代添食的重金屬在次代的殘留濃度［C］.纖維研究所研究報告第六號，2002：17.

［4］Sugiyama H，Emori T.Pesticide residues of MEP，MPP and PAP in mulberry stumps and its effect on the silkworm（Bombyx mori L）［J］.J Pesticide Sci，1980，5（3）：423～425.

［5］Hemingway Janet，Hawkes Nicola J，McCarroll Lynn.The molecular basis of insecticide resistancein mosquitoes［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34（7）：653～665.

［6］Oakeshott John G，Devonshire Alan L，Claudianos Charl. Comparing the 0rganoph0sphorus and carbamate insecticide resistance mutations in chol in-and carboxyl-esterases［J］.Chemico-Biological Interaction，2005，l57～158：269～275.

［7］林建國，張傳溪，唐振華.與昆蟲抗藥性相關(guān)的乙酰膽堿酯酶基因突變研究進展［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2005，7（1）：1～6.

［8］胡小邦，朱昌亮.昆蟲抗藥性機制研究進展［M］.國外醫(yī)學(xué)，寄生蟲病分冊，2004，31（1）：18～23.

［9］程家安，唐振華.昆蟲分子科學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001，218.

［10］Maitra Sushmita，Domhrowski Susan M，Waters Larry C. Three second chromosome-1 inked clustered C 6 genes show differential constitutive and barbital～induced expression in DDT-resistant and susceptible strains of Drosophila melanogaster［J］.Gene，1996，180（1～2）：165～171.

［11］SEINO A，KAZUMA T，JANG A，et a1.Analysis of two acetylch01.nesterase genes in Bombyx mori Pesticide Bio-chemistry and Physiology［J］.2007，88：92～101.

［12］SHANG J Y，SHAO Y M，LANG G J，et a1.Expression of two types of acetylcholinesterase gene from the silkworm，Bombyx mori，in insect cells.Insect Science［J］.2007，14（6）：443～449.

［13］冷欣夫，邱旱輝.細胞色素P450酶系的結(jié)構(gòu)功能與應(yīng)用前景［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：1～8.

［14］朱玉賢，李毅.現(xiàn)代分子生物學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2002：88～99.

［15］Feyereisen R，Koener J F，F(xiàn)arnsworth D E，et a1.Isolation and sequence of eDNA encoding a cytochmme P450 from an inseeticide·resistant strain of the house fly，Musca domestica［J］.Proc Natl Acad Sei USA，1989，86（5）：1465～1469.

［16］Carino F，Koener J F，Plapp F WJ，et a1.Expression of the cytochrome P450 gene CYP6Al in［M］.In：Mullin CA，Scott JG.Molecular Mechanisms of Insetticide Resistance：Diversity Among Insects，V01.ACS Symposium Series 505.Washington，D C：American Chemical Society，1992：3l～40.

［17］Wheelock G D，Scott J G.Immunological detection of eytochrome P450 from insecticide resistant and susceptible house flies（Muscadomeaica）［J］.Pestic Biochem Physial，1990，38：130～139.

［18］Tomita T，Scott J G.eDNA and deduced protein sequence ofCYP6DI：the putative gene for a cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in the housefly［J］.Insect Bioehem Mol Biol，1995，25：275～283.

［19］Dabom P J，Yen J L，Bogwitz M R，et al.A single P450 allele associated with insecticide resistance in Drosophila［J］.Science，2002，297：2253～2256.

［20］Rose R L，Barbhaiya L，Roe R M，et al.Cytochmme P450-associated insecticide resistance and the development of biochemical diagnostic assays in Heliothis virescens［J］. Pestic Biochem Physi ol，1995，51：178～191.

［21］Rose R L，Goh D，Thompson D M，et al.Cytochrome P450 CYP9A I in Heliothis virescens：the first member of a new CYP family［J］.Insect Biochem Mol Biol，1997，27：605～615.

［22］Scott J G.Cytochmmes P450 and insecticide resistance［J］.Insect Biochem Mol Biol，1999，29：757～777.

［23］Feyereisen R.Insect eytochrome P450［M］.In：Gilbert L，latrouK，Gill S.Comprehensive Molecular Insect Science. Oxford Elsevier Pergamon，2005：1～77.

［24］Hayes JD，F(xiàn)lanagan JU，Jowsey IR.Glutathione transferases［J］.Annu Rev Pharmacol Toxic01.2005，45：5l～88.

［25］Quanyou Yu，Cheng Lu，Bin Li，et a1.Identification，genomic organization and expression pattern of glutathione S-transferase in the silkworm，Bombyxmori［J］.INSECT BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY，2008，38：1158～1164.

［26］趙國棟，衛(wèi)正國，李兵，等.家蠶谷胱甘肽一S一轉(zhuǎn)移酶基因（BmGSTdl）的誘導(dǎo)表達定量分析［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（1）：46～51.

［27］許湲.家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe3基因的克隆和真核表達［D］.碩士論文.重慶：西南大學(xué)，2008.

［28］劉佳.家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BrnGSTe4基因的克隆和真核表達［D］.碩士論文.重慶：西南大學(xué)，2009.

［29］侯成香，桂仲爭.家蠶谷胱甘肽硫一轉(zhuǎn)移酶的組織分布及發(fā)育期變化規(guī)律［J］.蠶業(yè)科學(xué).2007，33（3）：409～413.

Research Progress and Biological Feasibility on Resistance of Silkworm to Pesticides

CAI Zi-zheng1，LU Yan1，LIU Xin-ju2,MIAO Yun-gen1
（1.College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.Sericultural Institute,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China）

Environmental pollution and the widespread use of chemical pesticides have become the main factors which affect the agricultural habitats.Due to the long-term artificial domestication and breeding,silkworms have a low stress resistance to the pesticides and the environment,which become one of the ideal biological indicators to study the pesticides or insecticides resistance.This article described the genes related to the resistance and main detoxification enzymes,characteristics and gene cloning and function of silkworm detoxification enzyme.

silkworm;resistance to the pesticides;detoxification enzymes;biological indicator

S886.7

C

0258-4069[2013]01-

教育部博士學(xué)科點專項科研基金（編號：20110101110100）；浙江科技計劃公益技術(shù)應(yīng)用研究農(nóng)業(yè)項目（課題編號：2012C22048）

作者介紹：蔡自崢，女（1988-），河南信陽人，碩士研究生，主要從事蠶桑資源極其分子生物學(xué)研究。E-mail:caizizheng911@126.com

繆云根，男，教授。E-mail:miaoyg@zju.edu.cn