內(nèi)毒素識(shí)別、內(nèi)化及清除相關(guān)受體的研究進(jìn)展＊

余夢辰 綜述，李 斌，周 紅 審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶 400038）

內(nèi)毒素（lipopolysaccharide／endotoxin，LPS）是革蘭陰性菌胞壁外膜主要成分，由3部分組成：O－特異性側(cè)鏈、核心多糖和脂質(zhì)A（Lipid A）。LPS進(jìn)入機(jī)體后，免疫細(xì)胞可通過相關(guān)模式識(shí)別分子識(shí)別LPS，誘發(fā)失控性炎癥反應(yīng)。其中，單核／吞噬細(xì)胞系統(tǒng)是LPS的主要效應(yīng)細(xì)胞，其胞膜表面的模式識(shí)別受體是識(shí)別啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素。肝臟是人體最大的清除外來有毒物質(zhì)的器官，肝枯否細(xì)胞是全身最大的組織巨噬細(xì)胞群，是清除降解LPS的重要免疫細(xì)胞，肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞也可充當(dāng)清道夫角色，可不依賴枯否細(xì)胞獨(dú)立清除LPS［1］。本文就近年來有關(guān)單核／吞噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)化清除LPS相關(guān)受體的研究進(jìn)展予以綜述。

1 mCD14

mCD14主要以GPI錨狀物附在單核／巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面，無跨膜結(jié)構(gòu)和胞漿段，需通過與Toll樣受體4（TLR4）相互作用參與LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。LPS進(jìn)入體循環(huán)后以聚合物形式存在，血漿中的脂多糖結(jié)合蛋白使LPS聚合物轉(zhuǎn)換為單體，形成LPS－LBP復(fù)合物與mCD14結(jié)合，再將LPS轉(zhuǎn)移到TLR4／MD－2復(fù)合物，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。LPS能刺激細(xì)胞表面LBP／mCD14表達(dá)上調(diào)，提高細(xì)胞對(duì)LPS敏感性，LPS的許多生物學(xué)效應(yīng)即通過此增敏效應(yīng)實(shí)現(xiàn)。

2 Toll受體家族

Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）家族是天然免疫系統(tǒng)中最重要的一類模式識(shí)別受體（PRR），結(jié)構(gòu)高度保守，能識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒和瘧原蟲等。TLRs為Ⅰ型跨膜蛋白，胞外區(qū)為富含亮氨酸的重復(fù)序列，胞內(nèi)區(qū)具有與Toll和白細(xì)胞介素1（IL－1）受體家族同源的結(jié)構(gòu)域 TIR［2］。目前已發(fā)現(xiàn)的TLRs有13種，分別識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），如 TLR2可識(shí)別革蘭陽性菌的細(xì)菌脂蛋白，TLR4則是LPS的識(shí)別受體。

2.1 TLR4 TLR4廣泛表達(dá)在單核／巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及上皮細(xì)胞中。LPS侵入機(jī)體后，可通過作用于TLR4下游的MyD88依賴和非MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。

（1）MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：在LBP和mCD14參與下LPS被轉(zhuǎn)運(yùn)至TLR4／MD－2復(fù)合物，MyD88招募IL－1受體相關(guān)激酶（IL－1receptor－associated kinase，IRAK），使IRAK 磷酸化而激活，而后IRAK－1從復(fù)合體上解離，結(jié)合于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor－associated factor 6，TRAF6）并使其活化［3］。TRAF6通過兩條途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，一是通過泛素化活化轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（transforming growth factor－B－activated kinase－1，TAK1），降 解 I－κB，活 化NF－κB誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因表達(dá)；二是通過（mitogen－activated protein kinases，MAPK）途徑，激活p38、JNK、ERK1／2等介導(dǎo)炎性因子表達(dá)［4］。

MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：TLR4胞內(nèi)段與TRAM（TRIF－related adaptor molecule）作用，進(jìn)而與 TRIF（Toll／IL－1Rdomain－containing adaptor inducing IFN－β）結(jié)合，磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor－3，IRF－3），誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄。TRIF還可通過TRAF6激活NF－κB，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因表達(dá)［5］。

TLR4也可介導(dǎo)LPS的內(nèi)化，TLR4識(shí)別游離的LPS后細(xì)胞質(zhì)側(cè)面的網(wǎng)格蛋白牽拉質(zhì)膜向內(nèi)凹陷，形成有被小泡。內(nèi)化的有被小泡形成內(nèi)體并和溶酶體融合，囊泡酸化后經(jīng)多種蛋白酶作用降解清除。阻礙LPS受體識(shí)別或封閉網(wǎng)格蛋白的表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致LPS內(nèi)化程度降低。研究表明LPS內(nèi)化不僅與其降解、代謝有關(guān)，也與細(xì)胞的活化有關(guān)，如內(nèi)體酸化抑制劑氯喹可通過影響早期體內(nèi)的成熟抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活化［6］，在LPS的內(nèi)化障礙模型中，LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放水平降低，且NF－κB的活化受到顯著抑制［7］。此外，許多負(fù)調(diào)控分子如IRAK－M，A20等也可對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起抑制作用。TLR4還與其他LPS識(shí)別受體相互協(xié)同、相互制約，共同參與維持機(jī)體平衡。

2.2 TLR2 TLR2是革蘭陽性菌的主要識(shí)別受體，也能識(shí)別LPS并介導(dǎo)細(xì)胞LPS反應(yīng)。但TLR2與LPS的親和力較低，當(dāng)TLR4存在時(shí)細(xì)胞對(duì)LPS的識(shí)別無須TLR2的參與。TLR2與TLR4也存在協(xié)同作用和交叉耐受作用，且在LPS誘導(dǎo)的醛固酮分泌過程中，TLR2與TLR4都參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間的溝通［8］。LPS刺激可導(dǎo)致TLR2mRNA在腦、肝、肺、腎的表達(dá)上調(diào)，但在脾臟中的表達(dá)下調(diào)。另有研究顯示，在LPS刺激下TLR2的蛋白水平表現(xiàn)為上調(diào)，然而在LPS與腺苷同時(shí)存在的情況下，TLR2的蛋白水平則呈下調(diào)。

3 清道夫受體

清道夫受體（scavenger receptor，SR）是巨噬細(xì)胞膜上帶有膠原結(jié)構(gòu)的三聚體膜蛋白，具有結(jié)合被修飾低密度脂蛋白等帶負(fù)電荷配體的活性?？煞譃?個(gè)家族，即SR A～H。近來的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞表面的SRs具有結(jié)合和清除細(xì)菌及LPS的作用。其中SR－A、SR－B是單核／吞噬細(xì)胞系統(tǒng)參與天然免疫的主要SR。

3.1 SR－A A型SR表達(dá)于大多數(shù)組織的巨噬細(xì)胞、骨髓來源樹突狀細(xì)胞、脾樹突狀細(xì)胞，是1種調(diào)控吞噬、降解LPS的防御性受體。SR－A可與LPS的Lipid A結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的網(wǎng)格蛋白依賴途徑介導(dǎo)對(duì)LPS的內(nèi)化后迅速移至溶酶體內(nèi)，經(jīng)脫磷酸和脫?；饔帽淮x、降解。與其他LPS受體不同的是，SR－A介導(dǎo)的LPS內(nèi)化清除不會(huì)激活巨噬細(xì)胞、誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放。SR－A表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞結(jié)合、內(nèi)化LPS，并抑制炎癥因子釋放和NF－κB活化。SR－A的激活還與TLR4誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可相互影響。一方面LPS刺激巨噬細(xì)胞后激活的SR－A可抑制TLR4誘導(dǎo)的細(xì)胞活化，從而降低炎癥因子的釋放［9］；另一方面，LPS通過激活的TLR4下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使巨噬細(xì)胞SR－A表達(dá)上調(diào)［10］。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，LPS刺激對(duì)SR－A表達(dá)的上調(diào)與TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無關(guān)，而是由p38信號(hào)通路調(diào)控［11］。

SR－A還可通過識(shí)別革蘭陰性菌胞壁上的LPS而直接與革蘭陰性菌結(jié)合，是多種革蘭陰性菌內(nèi)化入胞的識(shí)別受體。SR－A基因敲除小鼠更易受到細(xì)菌感染，且對(duì)革蘭陰性菌的吞噬能力會(huì)減弱［12］。

3.2 MARCO MARCO僅表達(dá)于脾邊緣區(qū)的巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞等部分巨噬細(xì)胞，因其結(jié)構(gòu)與SR－AⅠ高度相似而被劃分為SR－A，但功能和分布與SR－A有明顯差異。MARCO缺少SR－AⅠ的繞線式α螺旋結(jié)構(gòu)域，但有較長的膠原結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合細(xì)菌和被修飾LDL的作用，可通過其C末端的SRCR結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌結(jié)合，參與巨噬細(xì)胞對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的吞噬過程［13］。通常認(rèn)為LPS是 MARCO參與天然免疫反應(yīng)的主要配體，有研究顯示，MARCO的表達(dá)可受Toll受體激活的MyD88y依賴和非MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。但MARCO和SR－A在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎性因子釋放進(jìn)程中的行為不同，SR－A可抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的IL－12的釋放，但MARCO則可刺激IL－12的釋放。

3.3 SR－B B型SR是清道夫受體超基因家族成員，分為SRBⅠ、SR－BⅡ和CD36，參與機(jī)體脂類代謝、動(dòng)脈粥樣硬化形成與保護(hù)、細(xì)胞粘附和凋亡細(xì)胞的清除等生命過程。SR－BⅠ和CD36與LPS內(nèi)化清除有關(guān)，有關(guān)SR－BⅡ生理意義的研究尚少見。

SR－BⅠ主要在肝臟、腎上腺及脂肪組織中表達(dá)，與高密度脂蛋白有高度的親和性，是抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因子之一。體外實(shí)驗(yàn)表明，SR－BⅠ可與LPS直接結(jié)合，并促進(jìn)LPS的攝取與清除［14］。SR－BⅠ缺陷型小鼠對(duì)LPS誘導(dǎo)的LPS休克可表現(xiàn)出了更強(qiáng)的免疫炎癥反應(yīng)。SR－BⅠ也參與了肝細(xì)胞對(duì)血漿中LPS的清除，且這種清除作用在HDL的輔助下效率更高［15］。LPS可通過TLR2、TLR4的PI3K／Akt信號(hào)通路影響SR－BⅠ的表達(dá)［16］，NF－κB的活化對(duì)SR－BⅠ的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用［17］。SR－BⅠ亦可抑制TLR4誘導(dǎo)的 NF－κB的活化。

CD36是一種與SR－BⅠ高度同源的膜糖蛋白，可在血小板、單核／巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。研究表明，CD36可識(shí)別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，并可通過非TLR2／4依賴的JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［18］。

4 膜突蛋白

膜突蛋白（membrane－organizing extension spike protein，moesin）屬ERM（ezrin，radixin，moesin）家族成員之一，表達(dá)于單核／巨噬細(xì)胞的表面。早期研究認(rèn)為moesin主要在結(jié)合細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞的形狀、黏附及運(yùn)動(dòng)中起重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)還參與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)?？筸oesin抗體能劑量依賴性地抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF－α，皮下注射LPS在moesin－／－型小鼠體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)程度比對(duì)照組低3倍，說明moesin參與了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［19］。

moesin在CD14／TLR－4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色。LPS可與moesin的C末端結(jié)合，促進(jìn)moesin的表達(dá)和磷酸化。在LPS刺激過程中，moesin始終與CD14直接結(jié)合，并可與TLR－4／MD2復(fù)合物結(jié)合。阻斷 moesin后，LPS誘導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路被阻斷，p38、ERK以及NF－κB的活化均被抑制［20］。

5 ?；人崴饷福╝cyloxyacyl hydrolase，AOAH）

AOAH并非LPS識(shí)別受體，而是一種內(nèi)源性LPS水解酶，與LPS清除和LPS相關(guān)受體關(guān)系密切，因此將其一同納入綜述。AOAH主要分布于肝KCs、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，可選擇性水解LPS的脂質(zhì)A酰氧酰基基團(tuán)上的次級(jí)?；I，促使LPS的Lipid A結(jié)構(gòu)暴露從而被AOAH降解［21］。小鼠腹腔注射LPS后，肝、肺組織中的AOAH mRNA表達(dá)及活性均明顯提高。炎癥反應(yīng)時(shí)，AOAH可在胞內(nèi)水解LPS，也可在胞外發(fā)揮去?；饔?，但AOAH胞外水解LPS的活性較胞內(nèi)緩慢。AOAH還可降解革蘭陰性菌胞膜上的LPS，降解后的LPS（deacylated lipopolysaccharide，dLPS）可通過與LPS競爭性結(jié)合LBP、CD14或抑制IL－8的釋放從而阻礙完整的LPS刺激免疫細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，LPS的酰基鏈?zhǔn)荓PS與MD－2結(jié)合的關(guān)鍵部位，因此推斷dLPS由于與TLR4／MD－2結(jié)合受阻而阻斷LPS的刺激作用［22］。

研究顯示，Aoah－／－型小鼠和野生型小鼠同時(shí)靜脈注入LPS，Aoah－／－型小鼠較野生型小鼠更容易表現(xiàn)出不可逆的肝、脾腫大。而高表達(dá)AOAH基因的小鼠，LPS攻擊后恢復(fù)比野生型小鼠快，且可以避免小鼠出現(xiàn)肝、脾腫大［23］。但LPS或革蘭陰性菌攻擊的Aoah－／－型小鼠和Aoah＋／＋型小鼠存活率及炎癥反應(yīng)并無區(qū)別［24］。經(jīng)LPS預(yù)處理的Aoah－／－型小鼠對(duì)大腸埃希菌攻擊更為敏感，TNF－α和IL－6的釋放被延遲，且在細(xì)菌感染的最初24h，小鼠體內(nèi)的細(xì)菌大量繁殖［25］。提示AOAH可能是在LPS感染的晚期通過降低免疫細(xì)胞活性、抑制過度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。

6 展 望

LPS的識(shí)別與清除是由多器官、多系統(tǒng)協(xié)同參與的復(fù)雜的過程。許多種生物大分子參與LPS識(shí)別和清除，膿毒癥不同時(shí)期或／和不同階段需要不同的生物大分子的參與，發(fā)揮不同的生理作用，促使單核／吞噬細(xì)胞系統(tǒng)迅速清除、滅活LPS，并啟動(dòng)促炎癥和抗炎癥反應(yīng)，使機(jī)體免受損害。對(duì)參與LPS降解清除的相關(guān)模式識(shí)別受體和生物大分子之間相互關(guān)系做進(jìn)一步深入的研究，將有助于明確膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，為臨床膿毒癥防治提供新的理論依據(jù)。

［1］Stuart WD，Kulkarni RM，Gray JK，et al.Ron receptor regulates Kupffer cell－dependent cytokine production and hepatocyte survival following endotoxin exposure in mice［J］.Hepatology，2011，53（5）：1618－1628.

［2］Akira S，Uematsu S，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity［J］.Cell，2006，124（4）：783－801.

［3］Kawagoe T，Sato S，Jung A，et al.Essential role of IRAK－4protein and its kinase activity in Toll－like receptor－mediated immune responses but not in TCR signaling［J］.J Exp Med，2007，204（5）：1013－1024.

［4］Sato S，Sanjo H，Takeda K，et al.Essential function for the kinase TAK1in innate and adaptive immune responses［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1087－1095.

［5］H?cker H，Redecke V，Blagoev B，et al.Specificity in tolllike receptor signalling through distinct effector functions of TRAF3and TRAF6［J］.Nature，2006，439（7073）：204－207.

［6］Hong Z，Jiang Z，Liangxi W，et al.Chloroquine protects mice from challenge with CpG ODN and LPS by decreasing proinflammatory cytokine release［J］.Int Immunopharmacol，2004，4（2）：223－234.

［7］Wang Y，Yang Y，Liu X，et al.Inhibition of clathrin／dynamin－dependent internalization interferes with LPS－mediated TRAM－TRIF－dependent signaling pathway［J］.Cell Immunol，2012，274（1－2）：121－129.

［8］Wang L，Zhu R，Huang Z，et al.Lipopolysaccharide－induced toll－like receptor 4signaling in cancer cells promotes cell survival and proliferation in hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2013，58（8）：2223－2236.

［9］Ohnishi K，Komohara Y，F(xiàn)ujiwara Y，et al.Suppression of TLR4－mediated inflammatory response by macrophage class A scavenger receptor（CD204）［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，411（3）：516－522.

［10］Mukhopadhyay S，Varin A，Chen Y，et al.SR－A／MARCO－mediated ligand delivery enhances intracellular TLR and NLR function，but ligand scavenging from cell surface limits TLR4response to pathogens［J］.Blood，2011，117（4）：1319－1328.

［11］Xiang Q，Wen L，Liu MH，et al.Endotoxin tolerance of RAW264.7correlates with p38－dependent up－regulation of scavenger receptor－A［J］.J Int Med Res，2009，37（2）：491－502.

［12］Bieghs V，Verheyen F，van Gorp PJ，et al.Internalization of modified lipids by CD36and SR－A leads to hepatic inflammation and lysosomal cholesterol storage in Kupffer cells［J］.PLoS One，2012，7（3）：e34378.

［13］Chen Y，Wermeling F，Sundqvist J，et al.A regulatory role for macrophage class A scavenger receptors in TLR4－mediated LPS responses［J］.Eur J Immunol，2010，40（5）：1451－1460.

［14］Vishnyakova TG，Kurlander R，Bocharov AV，et al.CLA－1and its splicing variant CLA－2mediate bacterial adhesion and cytosolic bacterial invasion in mammalian cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（45）：16888－16893.

［15］Baranova IN，Vishnyakova TG，Bocharov AV，et al.Class B scavenger receptor types I and II and CD36mediate bacterial recognition and proinflammatory signaling induced by Escherichia coli，lipopolysaccharide，and cytosolic chaperonin 60［J］.J Immunol，2012，188（3）：1371－1380.

［16］Huang HL，Chiang MF，Lin CW，et al.Lipopolysaccharide directly stimulates aldosterone production via tolllike receptor 2and toll－like receptor 4related PI（3）K／Akt pathway in rat adrenal zona glomerulosa cells［J］.J Cell Biochem，2010，111（4）：872－880.

［17］Shibata N，Glass CK.Regulation of macrophage function in inflammation and atherosclerosis［J］.J Lipid Res，2009，50（S1）：277－281.

［18］Baranova IN，Kurlander R，Bocharov AV，et al.Role of human CD36in bacterial recognition，phagocytosis，and pathogen－induced JNK－mediated signaling［J］.J Immunol，2008，181（10）：7147－7156.

［19］Takamatsu H，Espinoza JL，Lu X，et al.Anti－moesin antibodies in the serum of patients with aplastic anemia stimulate peripheral blood mononuclear cells to secrete TNF－alpha and IFN－gamma［J］.J Immunol，2009，182（1）：703－710.

［20］Zawawi KH，Kantarci A，Schulze－Sp？te U，et al.Moesininduced signaling in response to lipopolysaccharide in macrophages［J］.J Periodontal Res，2010，45（5）：589－601.

［21］Gioannini TL，Teghanemt A，Zhang D，et al.Endotoxinbinding proteins modulate the susceptibility of bacterial endotoxin to deacylation by acyloxyacyl hydrolase［J］.J Biol Chem，2007，282（11）：7877－7884.

［22］Kim HM，Park BS，Kim JI，et al.Crystal structure of the TLR4－MD－2complex with bound endotoxin antagonist Eritoran［J］.Cell，2007，130（5）：906－917.

［23］Shao B，Lu M，Katz SC，et al.A host lipase detoxifies bacterial lipopolysaccharides in the liver and spleen［J］.J Biol Chem，2007，282（18）：13726－13735.

［24］Munford R，Lu M，Varley A.Chapter 2：kill the bacteria and also their messengers？［J］.Adv Immunol，2009，103（3）：29－48.

［25］Lu M，Varley AW，Ohta S，et al.Host inactivation of bacterial lipopolysaccharide prevents prolonged tolerance fol－lowing gram－negative bacterial infection［J］.Cell Host Microbe，2008，4（3）：293－302.