茶尺蠖病毒研究進展

王定鋒，王慶森，吳光遠

（福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015）

茶尺蠖（Ectropis obliquaProut）隸屬鱗翅目（Lepidoptera）尺蛾科（Geometridae），又名茶尺蛾，俗稱拱拱蟲、量寸蟲、吊絲蟲，分布于我國各主要產(chǎn)茶區(qū)，年發(fā)生代數(shù)多（約6代），產(chǎn)卵量大，常在局部茶園暴發(fā)成災(zāi)，是我國茶樹的主要害蟲之一。主要以幼蟲取食嫩葉和成葉，發(fā)生嚴重時可將茶樹食成禿枝，對茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)和茶樹樹勢影響較大，對夏、秋茶為害最重。除危害茶樹外，還可危害大豆、豇豆、芝麻、向日葵等[1-3]。盡管農(nóng)業(yè)防治和物理防治在茶尺蠖的防治中有采用[4-6]，但更多的還是使用農(nóng)藥防治，特別是化學農(nóng)藥[6-7]?；瘜W農(nóng)藥的長期大量使用，造成茶葉農(nóng)藥殘留超標、害蟲產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染等問題，正日益受到人們的重視。昆蟲病原微生物具有對靶標害蟲專一、不傷害天敵和環(huán)境友好等優(yōu)點，是害蟲綜合治理（Integrated Pest Management，IPM）的重要組成部分。本文就病毒的研究與應(yīng)用進展進行綜述，為更好地發(fā)掘、開發(fā)和利用這類病原因子提供參考。

1 茶尺蠖核型多角體病毒

隸屬于桿狀病毒科（Baculoviridae）A亞組的茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis obliqueNuclear Polyhedrosis Virus,EoNPV）對茶尺蠖幼蟲具有較高的致病力，可長期存在于茶園生態(tài)系統(tǒng)中，是該系統(tǒng)中制約茶尺蠖自然種群發(fā)展的重要病原微生物[8]。

1.1 EoNPV生物學特性

1977年趙燁烽等[9]在我國首次發(fā)現(xiàn)茶尺蠖病毒病的流行，并初步推斷致病因素是一種核型多角體病毒，而后朱國凱等[10]經(jīng)過鑒定進一步確認該病毒為核型多角體病毒。毛迎新[11]等應(yīng)用分子生物學技術(shù)明確了EoNPV湖北分離株是不同于安徽分離株的一個新的地區(qū)分離株。長期以來，國內(nèi)研究人員對EoNPV的形態(tài)學[12-13]、血清型[14]、毒性[8,15]和安全性[8,16-17]等生物學特性以及EoNPV對茶尺蠖幼蟲取食、生長發(fā)育的影響[18-19]及田間種群的控制[20]做了大量的研究，為進一步開展病毒的檢測、劑型的開發(fā)以及田間施用情況奠定了基礎(chǔ)。葉恭銀[21]等開展了3種主要環(huán)境因子（溫度、紫外線和茶園露水）對茶尺蠖核型多角體病毒毒力的影響，結(jié)果表明適于病毒感染各齡幼蟲的溫度范圍是 18～26℃；紫外線對離體病毒的影響與溫度及病毒濃度有關(guān)；而茶園露水對離體病毒無明顯影響。殷坤山[22]等試驗表明茶尺蠖核型多角體病毒對高溫和紫外較敏感，但對pH適應(yīng)范圍較寬。

1.2 EoNPV的擴繁

病毒的大量擴繁是實現(xiàn)病毒制劑規(guī)?；a(chǎn)和田間大面積示范推廣的先決條件，但病毒的擴繁卻受環(huán)境溫度[23-25]、飼毒濃度、寄主齡期[23]和寄主規(guī)?；曫B(yǎng)程度等條件的制約。吳曉晶[23]等研究表明，飼毒濃度是影響EoNPV產(chǎn)量的最主要因子，其次是飼毒時寄主幼蟲的蟲齡，在25℃，光暗比為9﹕15（h）時病毒產(chǎn)量最高；葉恭銀、胡萃[24-25]研究表明，26℃適于茶尺蠖核型多角體病毒（EoNPV）的增殖和病毒形態(tài)的正常發(fā)生。唐美君[26]研究表明在24℃下條件下用5×l05PIB/ml病毒液浸漬的葉片喂養(yǎng)茶尺蠖3齡中期幼蟲，病毒的產(chǎn)量最高，可達6.02×108PIB/頭。在明確病毒增殖影響因素的基礎(chǔ)上，室內(nèi)大規(guī)模飼養(yǎng)茶尺蠖以便進行活體繁殖病毒是當前面臨的最大難題之一。不少研究者對茶尺蠖人工飼料配方及室內(nèi)飼養(yǎng)條件進行了一系列的研究[27-31]，從蟲源選擇、飼料配方篩選和飼養(yǎng)條件入手，初步解決了茶尺蠖在冬季與早春因飼料不足導致繼代飼養(yǎng)困難的難題，為提供相同蟲齡的試臉材料以及增殖病毒的蟲源，打下基礎(chǔ)。盡管如此，茶尺蠖室內(nèi)大規(guī)模飼養(yǎng)仍然面臨規(guī)模較小而不能滿足大量病毒增殖的問題。郭睿[32]等則通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了感染茶尺蠖后可以擴增的重組家蠶核型多角體病毒（rBmNPV）為利用家蠶作為宿主來生產(chǎn)重組病毒殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)。

1.3 EoNPV制劑的研發(fā)與應(yīng)用

我國研究者通過一系列室內(nèi)試驗和田間實踐，不斷改進、完善EoNPV制劑。殷坤山等詳細介紹了適合基層茶場實際操作的茶尺蠖核型多角體病毒土法生產(chǎn)技術(shù)[33]；并在研究茶尺蠖病毒殺蟲劑田間使用技術(shù)后，提出要抓住茶尺蠖第1、2代和第5、6代的1～2齡幼蟲期[34]。洪北邊等篩選出具有一定抗紫外能力的茶尺蠖核型多角體病毒制劑EoNPV2H2和EoNPV2H4[35]，并開展了2種制劑的室內(nèi)和田間防治試驗，均取得了較好的效果[35-36]。葉恭銀等研究發(fā)現(xiàn)EoNPV病死蟲勻漿稀釋液抗紫外線能力最強，而加莧菜紅食品染料的提純病毒次之，在此基礎(chǔ)上篩選出適于高溫季節(jié)的茶尺蠖核型多角體病毒制劑EoNPV-Ⅰ乳劑，對茶尺蠖3齡初幼蟲殺蟲活性達 89.04%[37]。胡萃等從健蟲飼養(yǎng)、病毒增殖、病毒提取和病毒貯存四個方面詳細介紹了茶尺蠖核型多角體病毒的生產(chǎn)工藝流程[38]。為了適應(yīng)生產(chǎn)與市場需求，陳華才等研制了3種EoNPV制劑（EoNPV 乳劑、EoNPV-Bt乳劑、EoNPV-溴氰可濕性粉劑），并證實這3種制劑在室內(nèi)和田間對茶尺蠖的防治效果均在90%以上，此外，還進行了大面積的示范應(yīng)用，取得了較高的經(jīng)濟和生態(tài)效益[39]。為明確不同地理種群的茶尺蠖對EoNPV的敏感性存在較大差異的現(xiàn)象，席羽等對不同地理區(qū)域的茶尺蠖種群，進行了病毒毒效和毒力的生物測定，明確了茶尺蠖不同地理種群對EoNPV病毒的敏感性存在顯著差異，這為后續(xù)開展其機理研究及應(yīng)對策略提供基礎(chǔ)[40]。

在EoNPV制劑使用過程中，研究者還開展了EoNPV與農(nóng)藥混配的研究，以便提高殺蟲效果。葉恭銀等研究表明殺滅菊酯和硫酸銅對EoNPV具有一定的增效作用[37]。商建農(nóng)等研究發(fā)現(xiàn)EoNPV與敵滅靈、哇硫磷混用無增效作用[41]。徐健等的研究表明，Bt與EoNPV混配具有增效作用，并研制發(fā)出茶尺蠖病毒 Bt制劑尺蠖清（1.0×107 PIB/mLEoNPV + 2000 IU/mg Bt），大面積應(yīng)用對茶尺蠖防效可達92.4%，對茶園其它鱗翅目害蟲（茶毒蛾、刺蛾和茶銀尺蠖等）兼治效果達60%以上，保葉率達92.1%，而且對茶園天敵沒有殺傷作用[42-43]。殷向東等則研究了Bt與EoNPV混配的理想配比，為配比的最佳性判別建立了較為系統(tǒng)而可靠的基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用價值[44-45]。

1.4 EoNPV定性、定量檢測技術(shù)的建立

隨著茶尺蠖病毒在茶園中的大面積推廣應(yīng)用，研究該病毒的感染和復制機制及在自然界的流行規(guī)律，建立快速、穩(wěn)定、靈敏度高、特異性強而又安全的檢測方法至關(guān)重要。張永安等建立了基于茶尺蠖EoNPV多角體蛋白基因的PCR檢測技術(shù)，可以靈敏的檢測茶尺蠖子代卵和蛹中EoNPV的存在[46]。杜軍利等初步建立了茶尺蠖核型多角體病毒熒光定量 PCR檢測方法[47]，隨后袁志軍等對該檢測方法進行了優(yōu)化，使該方法能定性定量檢測茶尺蠖核型多角體病毒類生物農(nóng)藥以及監(jiān)測病毒對茶尺蠖的感染過程[48]。杜軍利等還制備能特異地與EoNPV病毒粒子蛋白結(jié)合的EoNPV的單克隆抗體，并建立了基于此單抗的ELISA檢測方法，從而提供了更為準確快速的EoNPV檢測技術(shù)[49]。而譚榮榮等利用提純的茶尺蠖核型多角體病毒蛋白，制備其特異性多克隆抗體，建立Indirect-ELISA檢測方法，為進一步研究該病毒的血清學特性及建立高通量、快速的病毒檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)[50]。

1.5 重組NPV病毒的研究

隨著對EoNPV分子生物學研究的深入，以及全基因組測序工作的完成，為利用基因工程技術(shù)改造菌株奠定了堅實的基礎(chǔ)[51-52]。為提高殺蟲速率，擴大殺蟲譜，林晨構(gòu)建了包含茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶（Chitin synthase，CS）CS1保守基因雙鏈干涉序列的重組 NPV病毒，并證明了重組病毒殺蟲效率明顯高于野生型出發(fā)菌株（尤其對低齡幼蟲），而且對蠶和石榴尺蠖也具有一定的殺蟲活性[53]。為了解決茶尺蠖飼養(yǎng)復雜而導致茶尺蠖核型多角體病毒（EoNPV）繁殖困難，郭睿等通過基因工程技術(shù)拓展了家蠶核型多角體病毒（rBmNPV），使經(jīng)家蠶擴增后的 rBmNPV重組菌株能夠感染茶尺蠖并在茶尺蠖體內(nèi)擴增，該研究為利用家蠶作為宿主來生產(chǎn)重組病毒殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)[32]。

2 茶尺蠖小RNA病毒

王小純等報道從茶尺蠖蟲尸上分離純化到一株新的非包涵體病毒，茶尺蠖小RNA病毒（Ectropis obliquapicorna-like virus）[54-55]，并對該病毒基因組結(jié)構(gòu)進行了分析[56-57]。林美娟等構(gòu)建了茶尺蠖小RNA病毒全長 cDNA克隆，為從分子水平研究EoPV病毒生物學特性、病毒復制機理等奠定了基礎(chǔ)[58]。Cheng等研究揭示了茶尺蠖小RNA病毒的2C蛋白RNA螺旋不穩(wěn)定和鏈退火加速活性，這可能是茶尺蠖小 RNA病毒復制和發(fā)病機理的關(guān)鍵，這些結(jié)果對我們理解小RNA病毒和病毒RNA分子伴侶有重要意義[59]。此外，武漢大學還以茶尺蠖核型多角體病毒和茶尺蠖小 RNA病毒為主體構(gòu)建了茶尺蠖雙病毒復合殺蟲劑，充分兼容了2種病毒的殺蟲優(yōu)勢，具有一定的應(yīng)用前景。

3 討論

茶尺蠖核型多角體病毒是一種高效、安全的生物農(nóng)藥，但由于其利用害蟲活體擴繁的特點，目前其生產(chǎn)規(guī)模仍然受限于茶尺蠖室內(nèi)規(guī)模化飼養(yǎng)階段。雖然前期已經(jīng)開展了大量茶尺蠖室內(nèi)飼養(yǎng)的研究[23-31]和利用基因工程技術(shù)構(gòu)建以家蠶作為宿主進行擴繁的重組病毒[32]，但在實際操作中還未能真正解決茶尺蠖大量飼養(yǎng)的難題。因此，今后有必要從蟲源的選擇、人工飼料配方和室內(nèi)飼養(yǎng)條件的優(yōu)化等幾個方面進一步研究茶尺蠖大量飼養(yǎng)的問題，以便滿足EoNPV商業(yè)化生產(chǎn)的需要。此外，茶尺蠖小RNA病毒雖然在分子生物學方面開展了大量的工作[56-59]，但在病毒擴繁、劑型開發(fā)及田間施用方面的研究還鮮有報道，今后可開展相關(guān)的研究，以便更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。與化學殺蟲劑相比，茶尺蠖病毒存在殺蟲速度慢、殺蟲譜窄、受環(huán)境因子影響較大等弊端。在篩選出高毒力病毒毒株的基礎(chǔ)上，除了優(yōu)化劑型配制外，利用基因工程技術(shù)來改良病毒毒株，可以獲得殺蟲毒力更強和殺蟲譜更寬的重組毒株[53]，通過改變宿主范圍來解決大量擴繁問題的重組毒株[32]以及具有更好環(huán)境適應(yīng)性的重組毒株。雖然利用基因工程技術(shù)改良的病毒毒株可以更好地滿足生產(chǎn)上的需要，但目前還缺乏關(guān)于重組病毒毒株對環(huán)境的安全性評估的相關(guān)報道，這也是今后有待深入研究的內(nèi)容。

前人已經(jīng)開展了大量EoNPV與其它農(nóng)藥混用的試驗[37,41-45]，針對茶尺蠖的防治藥劑也在不斷更新，所以有必要適時開展新型防治藥劑與EoNPV混用的試驗，以滿足生產(chǎn)上的實際需求。

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