PCR技術(shù)對(duì)侵襲性真菌感染診斷的研究進(jìn)展＊

毛曉露，石小燕綜述；盧忠心，胡麗華審校

（1.武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢430014；2.武漢市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，武漢430014；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢430022）

侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD），又稱(chēng)侵襲性真菌感染，是真菌侵入人體組織和血液，并在其中生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致組織損害、器官功能障礙和炎癥反應(yīng)的病理、生理過(guò)程。近年來(lái)，由于環(huán)境因素的危害和藥物因素影響（如免疫移植、腫瘤放化療、大劑量廣譜抗生素的長(zhǎng)期使用、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用等），造成了IFD的患病率和病死率均呈顯著上升趨勢(shì)。免疫力低下的IFD患者大多病情兇險(xiǎn)，常無(wú)特征性臨床表現(xiàn)，易被原發(fā)病或繼發(fā)細(xì)菌、病毒感染掩蓋，且對(duì)傳統(tǒng)抗真菌藥物的敏感性降低，故臨床早期診斷非常困難，后期治療十分棘手。真菌感染的檢測(cè)技術(shù)，目前以人工鏡檢、培養(yǎng)和組織病理檢查等傳統(tǒng)方法分析為主，但這些方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、敏感性較低且受主觀因素影響較大。因此，快速檢測(cè)此類(lèi)病原菌是治療和改善預(yù)后的關(guān)鍵。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，在一定程度上可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。本文就其在IFD快速診斷的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用遠(yuǎn)景進(jìn)行綜述。

1 PCR技術(shù)在診斷曲霉病中的應(yīng)用

由曲霉屬真菌感染引起的疾病包括過(guò)敏性支氣管肺曲菌病、肺曲霉球病和侵襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）。血液和肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）是臨床檢測(cè)的常規(guī)標(biāo)本。最近研究表明，大量血清和BAL沉渣與少量血清和經(jīng)離心BAL的上清液相比，更容易檢出真菌病原體［1］。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血液和BAL標(biāo)本進(jìn)行IA診斷分析有助于節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，可在物種水平鑒定基礎(chǔ)上更有針對(duì)性地進(jìn)行抗真菌藥物治療，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，并建議對(duì)PCR技術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化［2］。雖然PCR標(biāo)準(zhǔn)化有利于診斷性能的驗(yàn)證，但仍存在一些問(wèn)題，如DNA的提取效率提高至多少可以增加診斷的敏感性，哪類(lèi)臨床標(biāo)本更能有利于指導(dǎo)臨床診斷以及血中何種組分含有最多真菌DNA等。

2 PCR技術(shù)在診斷念珠菌病中的應(yīng)用

念珠菌是人體黏膜最常見(jiàn)的共生菌，也是免疫功能低下患者感染最常見(jiàn)的真菌病原體。約50%的感染由白色念珠菌引起，其他幾種念珠菌也可引起侵襲性疾病，如近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌等。由于念珠菌屬的基因決定了對(duì)不同抗真菌藥物敏感性有所不同，盡快正確鑒定念珠菌種屬以采取適當(dāng)?shù)乃幬镏委煂?duì)提高臨床療效和降低病死率非常重要。通過(guò)血培養(yǎng)檢測(cè)念珠菌的敏感性通常較低（大約為50%或更低），其他基于抗原、抗體和代謝物的念珠菌檢測(cè)技術(shù)都有各自的優(yōu)勢(shì)和價(jià)值，但缺乏特異性和敏感性。PCR檢測(cè)提供了一個(gè)快速診斷并正確鑒定念珠菌到達(dá)種屬水平的方法。念珠菌是口腔和上呼吸道的共生體，呼吸道標(biāo)本可能被念珠菌污染。因此，從呼吸道標(biāo)本分離出的念珠菌，包括支氣管鏡檢查和BAL（甚至標(biāo)本保護(hù)刷）的試樣，在沒(méi)有病原菌入侵的活檢證據(jù)時(shí)不考慮診斷為IFD。在BAL中檢測(cè)到高水平的念珠菌可建議診斷為念珠菌性肺炎，盡管這種臨床實(shí)例非常罕見(jiàn)。血液標(biāo)本由于最可能包含循環(huán)中完整有機(jī)體形式或細(xì)胞外形式的真菌DNA而作為首選的臨床檢測(cè)標(biāo)本。最近有研究對(duì)104例確診為非中性粒細(xì)胞減少患者的全血與血清進(jìn)行了PCR檢測(cè)分析，結(jié)果顯示血清的陽(yáng)性率可達(dá)100%，而全血的陽(yáng)性率只有70%，這表明血清比全血具有更高的敏感度［3－4］。

Morace等［5］分別用PCR和血培養(yǎng)方法檢測(cè)全血及血清中的念珠菌，結(jié)果顯示PCR技術(shù)具有更高的敏感性。Ahmad等［6］報(bào)道了通過(guò)半套式PCR檢測(cè)念珠菌rRNA基因操縱子的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）可鑒別混合念珠菌感染，而這種雙重感染通過(guò)培養(yǎng)不易檢出，特別是當(dāng)某一種菌株的增長(zhǎng)速度顯著增高時(shí)檢測(cè)更加困難。Dunyach等［7］對(duì)兩種實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了評(píng)估，一種是針對(duì)5種念珠菌的ITS區(qū)域，另一種是將18SrRNA作為目的基因，均通過(guò)熔融曲線(xiàn)形態(tài)來(lái)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ITS擴(kuò)增長(zhǎng)度的變異可導(dǎo)致分析靈敏度發(fā)生相應(yīng)變化，后者具有更高的靈敏度。

Maaroufi等［8］分別用血培養(yǎng)和實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)69例臨床確診或疑似系統(tǒng)性念珠菌感染患者的血液標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法的敏感性和特異性幾乎相當(dāng)。該P(yáng)CR檢測(cè)方法采用了兩種可變的水解探針，一種是只針對(duì)白色念珠菌的6－羧基熒光素（FAM）標(biāo)記探針，另一種是針對(duì)五大主要念珠菌的四氯－6－羧基熒光素（TET）標(biāo)記探針。兩種探針診斷的敏感性均為100%，特異性分別為97%和72%［9］。此外，這兩種探針與人類(lèi)rRNA基因的部分序列具有相似性，與其他生物體如曲霉屬、酵母菌和鐮刀菌等均有顯著的交叉反應(yīng)。由于念珠菌與許多其他常見(jiàn)的病原體相比，屬系發(fā)育更多樣化［10－12］，評(píng)估探針特異性以及引物和探針相互雜交的可能性是關(guān)鍵因素。此外，選擇合適的標(biāo)本種類(lèi)和提高核酸提取效率也非常重要［13－15］。

3 PCR技術(shù)診斷真菌感染的廣譜篩查

混合真菌感染（尤其在抗真菌治療）時(shí)，由于主菌的過(guò)度生長(zhǎng)，其他菌可能不易被檢測(cè)到。念珠菌屬的系統(tǒng)發(fā)育具有多樣性，對(duì)不同抗真菌藥物敏感性也有所不同。多重PCR在檢測(cè)真菌混合感染中可發(fā)揮重要作用。并非所有的病原真菌可以通過(guò)培養(yǎng)迅速繁殖，故陰性測(cè)試結(jié)果不能排除真菌感染的可能性［16］。廣譜PCR檢測(cè)的引物是針對(duì)該分類(lèi)單元中所有生物體的高度保守基因序列。例如，廣譜細(xì)菌PCR檢測(cè)引物的特異性是針對(duì)細(xì)菌高度保守基因16SrRNA或RNA聚合酶基因序列［17］。這些基因幾乎存在于所有細(xì)菌，且都包含與廣譜引物作用理想的保守區(qū)和有利于確定物種的可變區(qū)序列。從理論上講，廣譜真菌PCR檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)真菌病原體的檢測(cè)，將其與其他方法如熔融曲線(xiàn)分析相結(jié)合，可快速進(jìn)行物種鑒定［18］。

PCR擴(kuò)增可以針對(duì)真菌rRNA基因操縱子的ITS1區(qū)，并進(jìn)行測(cè)序，以確認(rèn)物種的身份。為鑒別臨床相關(guān)真菌病原體，除ITS的rRNA操縱子以外，18SrRNA基因與28SrRNA基因的高變序列D1－D2區(qū)也常作為PCR檢測(cè)的靶基因［19］。最近有研究表明，28SrRNA基因中D1－D2區(qū)以外的序列也可用于廣譜真菌PCR的檢測(cè)［20］。雖然大多數(shù)廣譜真菌PCR的研究都集中在有曲霉菌和念珠菌屬感染的患者，而Khot等［21］成功鑒別了多種真菌，包括念珠菌、隱球菌、孢霉菌、曲霉菌、鐮刀菌、絲孢菌屬、外小杯菌、明臍菌屬、鱗質(zhì)霉屬、放射毛霉屬和根霉菌屬。如果以培養(yǎng)和組織病理學(xué)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果準(zhǔn)確率分別為93.6%和64.3%。

與特定病原體屬種的PCR檢測(cè)相比，廣譜PCR檢測(cè)IFD的診斷特異性可能由于假陽(yáng)性率（false－positive，F(xiàn)P）較高而有所下降［22－24］。除了污染，F(xiàn)P較高可能由定植于采樣點(diǎn)的共生真菌引起，也可能由缺乏準(zhǔn)確的IFD臨床分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)造成。提高廣譜真菌PCR產(chǎn)物的物種鑒定水平是促進(jìn)解析假陽(yáng)性結(jié)果的關(guān)鍵因素。

PCR技術(shù)是診斷IFD的主要方向，但是如何繼續(xù)發(fā)展，目前有兩種觀點(diǎn)。第一種觀點(diǎn)認(rèn)為，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了通過(guò)PCR診斷真菌感染所需的大部分專(zhuān)有技術(shù)，現(xiàn)在是進(jìn)行大規(guī)模臨床檢測(cè)驗(yàn)證時(shí)期。第二種觀點(diǎn)則認(rèn)為，需要做更多的研究，以對(duì)臨床樣本進(jìn)行優(yōu)化選擇、進(jìn)一步改善樣本的收集和處理以及DNA提取方法、加強(qiáng)PCR檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)量控制等，以最大限度地提升診斷特異性，有效提高診斷效率。高分辨率的熔融溫度分析已廣泛用于種屬特定PCR或廣譜真菌PCR檢測(cè)，微球雜交技術(shù)如液相芯片技術(shù)等將更廣泛地用于PCR產(chǎn)物的物種水平鑒定和質(zhì)譜分析［25］。無(wú)論是單重PCR反應(yīng)還是多重PCR，將重點(diǎn)探討發(fā)展可用于診斷混合感染的分析方法，實(shí)時(shí)定量模式將成為真菌靶向檢測(cè)的規(guī)范。

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