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    胚胎干細胞的應(yīng)用研究

    2013-03-31 02:29:18邊育紅張艷軍天津中醫(yī)藥大學(xué)天津300193
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因胚胎毒性

    甄 珍,郭 英,邊育紅,張艷軍(天津中醫(yī)藥大學(xué),天津300193)

    ·現(xiàn)代醫(yī)學(xué)·

    胚胎干細胞的應(yīng)用研究

    甄 珍,郭 英,邊育紅,張艷軍*(天津中醫(yī)藥大學(xué),天津300193)

    胚胎干細胞(ES)是來源于早期胚胎內(nèi)細胞團(ICM)或原始生殖細胞(PGC)的一種多能細胞,具有體外無限復(fù)制和高度分化潛能的特性。目前,胚胎干細胞已逐漸應(yīng)用在胚胎干細胞體外測試(EST)與新藥開發(fā),移植治療與細胞替代治療,轉(zhuǎn)基因動物與克隆上,并已取得了一定的研究成果。

    胚胎干細胞;生物學(xué)特性;EST;新藥開發(fā);移植治療;細胞替代

    胚胎干細胞(ES)是來源于早期胚胎內(nèi)細胞團(ICM)或原始生殖細胞(PGC)的一種多能細胞。具有無限自我增殖的能力,即體外培養(yǎng)時ES細胞可以在一定的條件下保持不分化狀態(tài)且無限的自我復(fù)制。ES細胞還是一種全能干細胞,在特定條件下可向3個胚層的組織和細胞分化[1]。通常改變抑制ES細胞不分化狀態(tài)的培養(yǎng)條件,ES細胞就可以分化成多種細胞類型。ES細胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態(tài)及其多向分化潛能的生物學(xué)特性,使其廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域,它的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點。特別是在建立EST(胚胎干細胞體外測試)、新藥開發(fā)、細胞組織器官的移植治療和替代治療、轉(zhuǎn)基因動物與克隆上有著廣闊的應(yīng)用前景。

    1 EST與新藥開發(fā)

    1.1 EST 根據(jù)ES細胞的特性,有研究者[2]提出了EST預(yù)測模型,經(jīng)過許多研究的驗證發(fā)現(xiàn)ECVAM(歐洲替代方法驗證中心)項目中提出的體外毒性試驗是合理的。關(guān)于EST作為體外篩選和評價受試物的方法也為ECVAM所接受[3]。

    EST不僅可以研究藥物的細胞毒性,還可以研究胚胎發(fā)育毒性。EST與體內(nèi)測試相比,無需考慮藥物在動物體內(nèi)的代謝:與其他體外測試相比,不需大量的動物,其無限傳代的特性可以保證源源不斷的細胞供應(yīng);與細胞毒性測試相比,ES細胞比成體組織對藥物毒性的敏感性要高,并且更容易檢測受試物和代謝產(chǎn)物的濃度[4]。

    EST具體研究過程見參考文獻[2]。于洲等[5]在已經(jīng)建立的ES細胞經(jīng)體外誘導(dǎo)向心肌細胞分化的基礎(chǔ)上利用前期RA(視黃酸)體外誘導(dǎo)ES細胞向神經(jīng)細胞分化,建立ES細胞向神經(jīng)發(fā)育毒性評價的模型,通過評價了5-FU、DPH、青霉素的神經(jīng)發(fā)育毒性,初步驗證了該方法的有效性,從而對EST評價體系進行了豐富和完善。

    1.2 新藥開發(fā) 在藥物研發(fā)過程中體外實驗雖然不能完全取代體內(nèi)實驗,但細胞實驗可以作為其他實驗的先導(dǎo),為以后的體內(nèi)實驗提供行之有效的藥理藥代等數(shù)據(jù),減少實驗所需動物,減低成本。目前藥物開發(fā)過程中所用的細胞大都來源于動物細胞或癌細胞,這些細胞不能完全反應(yīng)人體對藥物作用的效果。ES細胞可以誘導(dǎo)分化成任何組織類型的細胞,在藥物開發(fā)過程中可以提供大量用于實驗的細胞。EC(歐共體)建立了一項有針對性的研究項目“InVitroHeart”,旨在開發(fā)人ES細胞源心肌細胞的體外毒性試驗。將人心肌細胞培養(yǎng)與電生理和細胞毒性微傳感器平臺結(jié)合標準化,已達到快速篩選藥物的目的[6]。另外,ES細胞在胚胎毒性測試和肝毒性測試中也取得了很大進展[7]。

    ES細胞還可用于創(chuàng)建動物模型,通過改變動物基因,建立與人類相似疾病的動物模型,應(yīng)用于藥物篩選的過程中,可以準確、快速的篩選出合適的藥物,目前這種方法已成為藥物篩選的手段之一[8]。近年來,興起的基因打靶技術(shù)是基于同源重組和ES細胞之上的一種可以定向改變生物體遺傳信息的實驗手段,同源重組是兩段含有相似核苷酸的DNA序列中自發(fā)交換遺傳信息的過程[9]?;虼虬屑夹g(shù)將含有已知序列的DNA片段與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組,整合到受體細胞基因組中并得以表達的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)[10]。ES細胞常用做基因打靶的靶細胞,利用基因打靶技術(shù)將外源DNA與ES細胞中的相似部分重組或靶向破壞等位基因,創(chuàng)建人類疾病的動物模型[11]。若將修飾過的ES細胞注入小鼠囊胚中,形成嵌合小鼠。從而在某些特定基因的研究過程中提供豐富的小鼠模型[12],有研究人員[9]建立了500多個關(guān)于癌癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)疾病等人類疾病的小鼠模型,用于制藥企業(yè)的藥物發(fā)現(xiàn)和篩選。

    2 移植治療和細胞替代治療

    ES細胞在特定條件下可向3個胚層的組織和細胞分化。3個胚層包括外胚層、中胚層、內(nèi)胚層。外胚層可以分化產(chǎn)生外周、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、上皮系統(tǒng)的細胞等。中胚層可以分化為肌肉、骨、軟骨、造血和結(jié)締組織及上皮組織等。內(nèi)胚層可以分化成胰細胞、肝細胞等[13]。由疾病或外傷導(dǎo)致的細胞損傷都可以通過將ES細胞定向分化成的特異性組織細胞或器官來治療。由于心肌損傷導(dǎo)致的心臟病會使具有完整收縮功能的心肌細胞的數(shù)量減少,因此治療的關(guān)鍵是要增加具有完整收縮功能的心肌細胞數(shù)量。Min JY等[14]將經(jīng)過綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的ES細胞注入由于左冠狀動脈前降支結(jié)扎造成的心肌梗死(MI)引起的損傷心肌上,ES細胞移植6周后,MI動物心臟功能獲得顯著改善,且MI區(qū)域的心肌切片呈GFP陽性且有典型的條紋、心肌肌節(jié)α-肌動蛋白、心臟α-肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白Ⅰ的強陽性證實移植的細胞存活和向心肌細胞的分化。這些數(shù)據(jù)表明,ES細胞移植是可行的,有望成為治療心肌梗死等心肌損傷性疾病的新方法。

    目前臨床上對于燒傷或創(chuàng)傷的患者主要是通過自身皮膚移植來治療,但是嚴重的燒傷或創(chuàng)傷的患者根本無法進行移植治療,ES細胞可誘導(dǎo)分化成表皮干細胞用于治療燒傷或創(chuàng)傷。劉愛軍等[15]將ES細胞源性的表皮干細胞移植到小鼠全層皮膚創(chuàng)傷面上,發(fā)現(xiàn)不僅能修復(fù)缺損表皮,而且有分化為汗腺樣、毛囊樣結(jié)構(gòu)的潛能。

    ES細胞還可以用來治療喪失正常細胞功能的疾病如退行性病變、遺傳性疾病和腫瘤等。帕金森病(PD)是由于腦中多巴胺神經(jīng)元丟失而導(dǎo)致的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。迄今,無論是藥物還是手術(shù)治療都無法根治。而利用細胞替代治療,將ES細胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化成產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)細胞,再將這些細胞注入病變區(qū)域,就有可能治療帕金森病。體外誘導(dǎo)ES細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法可以采用經(jīng)典五步法,此方法通過模仿體內(nèi)ES細胞的生長分化環(huán)境,逐步改變ES細胞的培養(yǎng)液成分,添加不同的生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等,誘導(dǎo)ES細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化。這種方法簡單,對細胞毒性小,且分化成的多巴胺能神經(jīng)元較純。劉平等[16]利用無血清培養(yǎng)基的篩選和培養(yǎng),在SHH和FGF8等細胞因子的共同作用下使其定向分化成為絡(luò)氨酸氫化酶陽性的神經(jīng)元。此外,與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)、基因修飾等方法也可產(chǎn)生純度較高的多巴胺能神經(jīng)元。

    許多Ⅰ型糖尿病患者體內(nèi),生成胰島素的β細胞及其他功能性細胞都被破壞。Lumelsky等[17]將ES細胞誘導(dǎo)分化成為能分泌胰島素和其他胰腺內(nèi)分泌激素的正常的胰島細胞,注入糖尿病鼠后形成了胰島樣結(jié)構(gòu)。如果將這些ES細胞分化成的胰島樣細胞移植入患者體內(nèi),就可能使糖尿病從根本上得到治療。

    3 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物與克隆

    3.1 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物是基因組中含有外源基因的動物。通過細胞融合、細胞重組等技術(shù)將外源基因?qū)刖?、卵子或受精卵中,通過生殖,在后代中形成可能會有攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方法是將目的基因注射到受精卵中,目前人們已成功的獲得了轉(zhuǎn)基因鼠、雞、豬、牛等動物。但此方法只能在個體水平上進行,且工作困難、效率低、周期長。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高,目前可以在細胞水平上篩選出最佳的細胞系,通過定向改變ES細胞,使其攜帶理想的目的基因,再將轉(zhuǎn)基因的ES細胞注入到受精卵中或?qū)⑥D(zhuǎn)基因的ES細胞與胚胎共培養(yǎng),使ES細胞與正常胚胎形成嵌合體,在下一代中將出現(xiàn)計劃中的轉(zhuǎn)基因動物。這種方法無需大量的動物且周期短,極大地提高了動物的生殖效率。Wood SA等[18]將小鼠胚胎與ES細胞共同培養(yǎng),形成嵌合胚,這種方法生產(chǎn)的小鼠ES細胞嵌合率很高,大大降低了實驗者的時間和精力。轉(zhuǎn)基因動物還可以用來生產(chǎn)基因工程藥物,將某些有預(yù)防或治療作用的藥用蛋白質(zhì)的基因提取出來,導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因動物中,就可以從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁和血液中提取大量的這種藥用蛋白質(zhì),來滿足臨床和試驗的需求。

    3.2 克隆 體細胞核移植即克隆,是近年來出現(xiàn)的一種新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。體細胞核移植是將外源基因與供體細胞共培養(yǎng),使外源基因整合到供體細胞上,然后將供體細胞的細胞核移植到受體細胞(去核卵母細胞)上,構(gòu)成重建胚,在將其移植到假孕母體上分娩,得到轉(zhuǎn)基因動物。1996年英國制造了第一只體細胞核移植的克隆的動物綿羊多利。目前已經(jīng)成功克隆出牛、羊、狗等多種動物。有實驗者[19]利用核移植將牛的ES細胞核移植到去核卵母細胞中,形成重建胚,再移植入牛的受體子宮內(nèi),后經(jīng)過超聲檢查,發(fā)現(xiàn)有胎兒存活。利用ES細胞進行核移植可以快速繁育優(yōu)良物種,加快動物的育種工作,在保護珍稀物種方面有重大意義。

    4 現(xiàn)存問題

    4.1 控制ES細胞定向分化 細胞分化是一個復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程,且ES細胞容易自主分化,對培養(yǎng)條件要求較高,對多種細胞因子、培養(yǎng)液環(huán)境等的影響敏感。要誘導(dǎo)ES細胞向預(yù)期方向分化,必須深入研究分化過程中所需的最佳環(huán)境。

    4.2 移植帶來的免疫排斥反應(yīng) ES細胞移植時會因供體和受體的ABO血型抗原、主要組織相容性抗原、次要組織相容性復(fù)合物抗原的不同而誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)[20]。

    4.3 ES細胞成瘤性 ES細胞可以無限增殖,如何控制其分化數(shù)量,使其達到足夠的治療數(shù)目且不會無限增殖而引起畸胎瘤仍需深入研究。

    4.4 轉(zhuǎn)基因動物存活率 目前克隆的成功率較低,且克隆成功的動物多數(shù)表現(xiàn)出嚴重的生理或免疫機能缺陷等問題,最終導(dǎo)致死亡。因此,克隆技術(shù)仍需進一步的研究深入。

    除去現(xiàn)有技術(shù)和研究的不足外,影響ES細胞應(yīng)用的最大問題即倫理問題,其關(guān)鍵問題是如何判定人格和生命。儒家學(xué)者認為人是有精神心理活動的有形體,胎兒不具備這些活動,所以不能稱之為人。也有很多社會倫理學(xué)家認為胚胎即意味著新的生命開始,其權(quán)利需要得到保護。但更多科學(xué)界人士更傾向于14d內(nèi)的胚胎不是人格的生命,不具備神經(jīng)系統(tǒng)和大腦,不會感覺到疼痛,故而不應(yīng)給予胚胎完全人權(quán),可以用于生命科學(xué)的研究[21]。

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    R331.2

    B

    1007-4813(2013)02-0319-03

    2012-10-28)

    中國博士后科學(xué)基金資助項目(200902281);國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2011CB505302)。

    甄 珍(1987-),女,碩士研究生。研究方向:中藥藥理學(xué)。

    *

    張艷軍,男,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,E-mail:zyjsunye@163.com。

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