HMGB1／SREBP-1參與IFN-γ介導的小鼠腎小球系膜細胞內的脂質沉積*

張玉軍，陳硯凝，鄭書深，劉青娟，郝 軍，韓 嫣，楊保衛(wèi)，劉淑霞△

（1．河北醫(yī)科大學病理教研室，石家莊050017；2．河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科，石家莊050012；3．石家莊人民醫(yī)學高等專科學校，石家莊050091；4．河北醫(yī)科大學，石家莊050017；5．解放軍總參三部保定干休所衛(wèi)生所，河北保定071000）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）重要的并發(fā)癥，也是患者死亡的重要原因之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者常伴有脂代謝的異常，低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低是其重要的特點，同時脂代謝異常的水平與患者的疾病活動度有關［1-3］。另有研究顯示，脂代謝異常與患者的腎臟損害密切相關。

我們的前期試驗結果顯示，SLE患者伴有血脂水平的升高，且升高與LN的發(fā)生密切相關；同時動物實驗顯示，在狼瘡性腎炎小鼠腎組織中系膜區(qū)油紅O染色陽性，提示在狼瘡性腎炎腎組織中有脂滴沉積，同時伴有小鼠血脂升高，推斷在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中伴有脂代謝的異常，但脂質沉積的機制如何，有待于進一步證實。

高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）作為一種晚期炎癥介質參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，且于狼瘡性腎炎患者及小鼠血清和腎組織中均表達上調［4］，但其表達與腎小球系膜細胞的脂質沉積是否有關及可能機制，目前尚不清楚。

因此，本研究以小鼠系膜細胞為研究對象，觀察γ-干擾素是否引起其脂質沉積，并通過觀察HMGB1、SREBP-1及脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）的表達變化，探討其可能機制。

1 材料與方法

1．1 材料

油紅O、IFN-γ和重組HMGB1購自Sigma公司。Trizol和 Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司。兔抗固醇調節(jié)元件結合蛋白-1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）、鼠抗 FAS單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗HMGB1抗體購自Abcam公司，小鼠抗β-actin抗體和辣根酶標記羊抗兔或羊抗小鼠二抗均購自北京中杉金橋公司。電化學發(fā)光（electrochemilu-minescence，ECL）試劑購自美國 Santa Cruz公司。

1．2 細胞培養(yǎng)及分組

1．2．1 細胞 小鼠系膜細胞（MMC：ATCC No．CRL-1927）為本實驗室凍存，以含5%胎牛血清的DMEM／F12（DMEM∶F12＝3∶1）培養(yǎng)基，于 37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1．2．2 細胞分組 （1）為了檢測 IFN-γ對 MMC中HMGB1、SREBP-1、FAS表達的影響，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細胞無血清培養(yǎng)24 h后隨機分成2組：對照組（N）和 IFN-γ（500 IU／ml）刺激組（IFN-γ組），分別于0，2，4、6、8，12 h收集不同時間點細胞；（2）為了進一步確定HMGB1在IFN-γ誘導的MMC細胞脂質沉積中的作用，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細胞隨機分為四組：正常對照組（control）；IFN-γ（500 IU／ml）刺激組（IFN-γ組）；IFN-γ＋sh-HMGB1組和 IFN-γ＋空質粒組，于IFN-γ刺激8 h時收集細胞；（3）為了確定HMGB1是否通過上調SREBP-1表達誘導MMC細胞的脂質沉積，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細胞隨機分為四組：正常對照組（control）；HMGB1（0．1 mg／L）刺激組（HMGB1組）；HMGB1＋sh-SREBP-1組和 HMGB1＋空質粒組，于HMGB1刺激8 h時收集細胞。

1．3 細胞轉染

采用脂質體2000進行細胞轉染（具體步驟按照說明書進行）。將常規(guī)培養(yǎng)的 MMC細胞（融合80%）時分為正常對照組、單純刺激組、刺激＋空質粒組和刺激＋質粒轉染組（2．0μg DNA＋4μl Lipofectamine 2000／2 ml無血清培養(yǎng)基），轉染12 h后單純刺激組、刺激＋空質粒組和刺激＋質粒轉染組中分別加入 IFN-γ（500 IU／ml）或 HMGB1（0．1 mg／L），于刺激8 h時收集細胞進行相關指標的檢測。

1．4 油紅O染色檢測MMC細胞中脂質沉積

將4%多聚甲醛固定的細胞取出后浸泡入PBS中5 min，油紅O染色15 min，異丙醇分化液中分化數(shù)秒，蒸餾水沖凈，淡蘇木素染色5 min，沖凈后甘油明膠封片。

1．5 蛋白印記（Western blot）檢測 MMC細胞中HMGB1、SREBP-1和FAS蛋白的表達

收集不同時間點細胞，低溫下加入約5倍體積的裂解緩沖液，冰上裂解 30 min，低溫高速離心（4℃、12 000 r／min、20 min），上清液即為所提取的蛋白溶液。采用考馬斯亮藍試劑法進行蛋白定量。等量蛋白（50μg）進行SDS-PAGE電泳，轉膜，以5%脫脂奶粉 37℃封閉 2 h，加入兔抗 HMGB1（1∶1 000）、SREBP-1（1∶400）、鼠抗 FAS（1∶500）和β-actin（1∶1 000）抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后以HPR標記的 IgG二抗（1∶5 000）37℃封閉 2 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光成像。底片透掃后以LabWorks 4．5軟件對條帶進行定量分析，目的蛋白表達以目的條帶和βactin條帶積分光密度值的比值（IOD值）代表目的蛋白的相對表達量。

1．6 RT-PCR檢測細胞中 HMGB1、SREBP-1和FASmRNA表達

Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計定量。取等量RNA，以M-MLV反轉錄為cDNA，TaqDNA聚合酶催下進行PCR擴增，引物序列見表1。將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后進入凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國UVP公司）進行吸光度掃描，以管家基因β-actin作為內參照校正，用目的基因的吸光度和β-actin吸光度的比值作為目的基因的相對表達含量。

Tab．1 Primers and product for HMGB1，SREBP-1，F(xiàn)ASandβ-actin

1．7 統(tǒng)計學處理

所有計量資料均用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用多重比較的方差分析。

2 結果

2．1 IFN-γ能夠誘導MMC細胞內脂質增多

油紅O染色顯示正常組MMC細胞內未出現(xiàn)明顯脂滴，而IFN-γ刺激組8 h時MMC細胞即可以出現(xiàn)紅染脂滴顆粒，刺激12 h紅染的脂滴顆粒與8 h相比沒有明顯的變化（圖1）。

2．2 IFN-γ 能夠上調 MMC細胞中 HMGB1、SREBP-1和FASmRNA及蛋白表達

RT-PCR結果顯示，IFN-γ刺激能夠上調HMGB1、SREBP-1和FASmRAN的表達，并呈時間依賴性（圖2A）。Western blot結果顯示，與0 h相比，IFN-γ組 HMGB1、SREBP-1和 FAS蛋白表達明顯升高，呈時間依賴性，12 h時 HMGB1、SREBP-1和 FAS蛋白的 IOD值分別為（1．79±0．04）；（1．15±0．02）和（0．96±0．09）明顯高于 0 h，2 h，4 h和 8 h（圖2B，P＜0．05）。

Fig．1 Lipid droplets formation in MMCcells induced by IFN-γin MMC cells at 8 h（Oil Red O staining×400）A：Control group；B：IFN-γ group；C：IFN-γ＋sh-HMGB1 group；D：HMGB1＋sh-SREBP-1 group；MMC： Mouse mesangial cells；IFN-γ：Interferon-γ；HMGB1：High mobility group protein 1；SREBP-1：Sterol regulatory element binding protein-1

Fig．2 Expression of SREBP-1，F(xiàn)AS，HMGB1 mRNA and protein in MMCcells detected by RT-PCR and Western blotA：RT-PCR；B：Western Blot；SREBP-1：Sterol regulatory element binding protein-1；FAS：Fatty acid synthetase；HMGB1：High mobility group protein-1**P＜0．05 vs 0 h group

2．3 sh-HMGB1能夠降低 IFN-γ誘導的 MMC細胞中SREBP-1、FAS蛋白表達，并且降低細胞內脂質沉積

與正常對照組相比，IFN-γ能夠上調 SREBP-1和 FAS蛋白的表達；而 IFN-γ＋sh-HMGB1組中SREBP-1和FAS蛋白表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（圖 3，P＜0．05）。油紅 O染色顯示，在IFN-γ刺激組MMC細胞的胞漿中可見明顯的紅染的脂滴顆粒，但在IFN-γ＋sh-HMGB1組中未見明顯的紅染脂滴顆粒（圖1）。

Fig．3 Expression of SREBP-1 and FASprotein in MMCcells detected by Western blot A：Western blot；B：Densitometric scanning；1：Control；2：IFN-γ；3：IFN-γ＋sh-HMGB-1；4：IFN-γ＋sh-Scramble*P＜0．05 vs control； ＃P＜0．05 vs IFN-γ

2．4 沉默SREBP-1表達能夠降低HMGB誘導的MMC細胞中SREBP-1蛋白表達和脂質沉積

與對照組相比，HMGB刺激能夠上調MMC細胞SREBP-1和FAS蛋白表達，刺激8 h時達高峰，12 h稍有下降，并伴有細胞內脂質沉積（圖 4）；采用siRNA技術沉默MMC細胞中SREBP-1表達能夠減少HMGB誘導的FAS蛋白表達和細胞內脂質沉積（圖1）。

3 討論

狼瘡性腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡重要的并發(fā)癥，其伴有多種臨床表現(xiàn)如高血脂、糖代謝異常、高血壓等。目前國內外學者研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡性腎炎患者和實驗動物腎組織中可見脂質沉積并且伴有血脂升高；我們的前期實驗也顯示，狼瘡性腎炎患者和BXSB鼠（狼瘡鼠模型）16周時均可出現(xiàn)血脂升高，油紅O染色發(fā)現(xiàn)在腎組織中可見紅染的脂滴顆粒，因此我們推斷，狼瘡性腎炎發(fā)病過程中伴有腎組織的脂質沉積，但其機制如何，目前尚不清楚。

目前大多觀點認為，狼瘡性腎炎的發(fā)生與免疫系統(tǒng)功能異常、各種細胞因子分泌及表達紊亂有關。多種細胞因子共同作用參與了腎炎的發(fā)生。γ-干擾素是狼瘡性腎炎發(fā)病過程中重要的細胞因子，且在疾病早期就可以出現(xiàn)［5］，具有多種生物學功能。為了闡明狼瘡性腎炎發(fā)病過程中脂質沉積的可能機制，本研究以 IFN-γ為刺激物，油紅 O染色觀察MMC細胞中脂質沉積的情況，結果顯示，IFN-γ刺激組MMC細胞的胞漿中可見明顯的紅染的脂滴顆粒，提示IFN-γ能夠誘導MMC細胞出現(xiàn)脂質沉積。

HMGB1參與了多種免疫性疾病的發(fā)生過程。HMGB1作為一種核蛋白被首次發(fā)現(xiàn)。同時其作為炎性因子和免疫佐劑的作用受到了更多的重視。HMGB1可由單核巨噬細胞釋放，同時可在LPS、TNF-α等炎性因子刺激下由受損細胞或壞死細胞釋放，并反過來作用于受損細胞，促使更多炎性因子釋放并發(fā)揮作用，從而放大了炎癥反應。目前研究顯示，胞外的HMGB1是一種重要的晚期炎癥介質，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［8，9］。我們的前期實驗顯示，HMGB1是狼瘡性腎炎發(fā)病過程中重要的細胞因子［10］，但其是否參與 IFN-γ介導的 MMC細胞中的脂質沉積國內外未見報道。SREBPs屬于螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指（bHLH-Zip）轉錄因子家族，其包括SREBP-1和 SREBP-2，SREBP-1基因位于17號染色體，有19個外顯子和18個內含子，其mRNA長度約為4 154 bp，翻譯的成熟片段分子量為 68 kD，SREBP-1可調控脂肪酸和甘油三酯的合成［6］。我們的前期研究顯示，SREBP-1參與高脂飲食引起的腎臟小管細胞脂質沉積［7］。但其是否參與HMGB1誘導的MMC細胞脂質沉積目前尚不清楚。

本實驗再次證實，IFN-γ能夠提高體外培養(yǎng)的MMC細胞HMGB1mRNA及蛋白表達，同時SREBP-1及其下游基因FASmRNA及蛋白表達均明顯升高，沉默HMGB1后能夠顯著降低IFN-γ誘導的SREBP-1和FAS蛋白的表達，同時降低細胞內脂質沉積。

本研究還發(fā)現(xiàn)：重組HMGB1能夠上調細胞內SREBP-1和 FAS蛋白表達；采用 siRNA技術沉默SREBP-1表達后，F(xiàn)AS蛋白表達降低，且細胞中紅染的脂滴顆粒明顯減少。

因此，綜上所述，我們認為上調HMGB1／SREBP／FAS表達是IFN-γ介導小鼠系膜細胞脂質沉積的可能機制之一。

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