維康顆粒對(duì)疲勞型亞健康小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉艷艷 孫曉敏 歐陽(yáng)明子 李玉萍 譚 為 程靜茹 羅 仁 趙曉山

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515）

亞健康是目前影響我國(guó)公共衛(wèi)生的重要問題。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示疲勞是亞健康狀態(tài)的最主要表現(xiàn)之一，疲勞型亞健康是亞健康的主要類型[1]。免疫系統(tǒng)是機(jī)體最重要的防御器官，與人體健康息息相關(guān)，臨床很多疾病的發(fā)病均涉及到免疫系統(tǒng)異常。目前認(rèn)為疲勞型亞健康可能存在免疫功能的異常。本實(shí)驗(yàn)擬采用臨床確切有效的中藥復(fù)方維康顆粒，觀察其干預(yù)對(duì)疲勞型亞健康小鼠胸腺、脾臟及其T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響，探討免疫功能在疲勞型亞健康發(fā)生中的作用及維康顆粒干預(yù)的藥理機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的SPF級(jí)健康KM小鼠100只，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002，雄性，體重 18～22g。

1.2 試劑與藥品 實(shí)驗(yàn)試劑：刀豆蛋白A、脂多糖購(gòu)自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液為天津TBD有限公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒為上海碧云天科技有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料公司。藥品：維康顆粒藥物（由熟地、淮山藥、黨參、山萸肉、黃精、陳皮組成，質(zhì)量比例為8∶4∶4∶4∶6∶3），由南方醫(yī)院藥學(xué)部提取制成顆粒劑，規(guī)格：10g/包，人用法用量：10g/次，2 次/d，口服。

1.3 主要儀器 Sigma離心機(jī)、恒溫游泳箱、37℃恒溫水浴鍋、5%CO2培養(yǎng)箱、凈臺(tái)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、小鼠飼養(yǎng)盒等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 疲勞型亞健康小鼠模型的建立 采用我們已建立的方法造模，即每天強(qiáng)迫小鼠水中站立8h，連續(xù)9d制備疲勞型亞健康小鼠模型[2]。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 實(shí)驗(yàn)前全部小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，剔除游泳時(shí)間及體重差異較大的小鼠，篩選出KM小鼠80只，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、疲勞型亞健康模型組（模型組）、維康顆粒干預(yù)組及模型自然恢復(fù)組，每組20只（其中10只用于力竭游泳測(cè)試，10只用于免疫功能和其他指標(biāo)檢測(cè)）。實(shí)驗(yàn)處理：模型組造模結(jié)束后檢測(cè)有關(guān)指標(biāo)；維康顆粒干預(yù)組造模結(jié)束后，給予維康顆粒灌胃，劑量為3g/kg，給藥體積為20mL/kg，連續(xù)7d；正常對(duì)照組、模型自然恢復(fù)組給予相應(yīng)體積的生理鹽水作為對(duì)照，連續(xù)7d。

2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.3.1 小鼠外觀行為學(xué)觀察 觀察實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、飲食、二便以及爪、鼻、唇、耳等色澤的變化。

2.3.2 疲勞程度測(cè)定 以力竭游泳時(shí)間測(cè)定小鼠疲勞程度。即用7%自身重量的鉛墜系于小鼠尾部后，將負(fù)重小鼠放入水溫25℃的水桶中進(jìn)行力竭游泳測(cè)試，力竭游泳標(biāo)準(zhǔn)為小鼠鼻尖沉入水下10s。

2.3.3 小鼠免疫功能指標(biāo) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組小鼠脾臟及胸腺指數(shù)，T、B淋巴細(xì)胞增殖能力。

2.4 標(biāo)本采集與制備

2.4.1 脾臟及胸腺指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（模型組為第10天，其余各組為第17天），將小鼠頸椎脫臼處死，摘取脾臟、胸腺，濾紙吸去表面液體，用電子精密天平稱取其質(zhì)量。脾臟（胸腺）指數(shù)=脾臟（胸腺）質(zhì)量（mg）/小鼠質(zhì)量（g）。

2.4.2 脾淋巴細(xì)胞的制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，迅速將其放入75%乙醇中浸泡3min，超凈臺(tái)下，剪開皮膚和腹壁，剝離脾臟移入盛有hanks’液的培養(yǎng)皿中。取實(shí)驗(yàn)前預(yù)先準(zhǔn)備的15mL離心管（管口覆蓋200目尼龍網(wǎng)，經(jīng)無菌消毒），將脾臟置于篩網(wǎng)上，1mL注射器芯輕輕研磨脾臟，無血清1640小心吹打過濾脾臟，收集脾細(xì)胞懸液4mL。另取離心管加入4mL淋巴細(xì)胞分離液，吸取4mL脾細(xì)胞懸液輕輕加于淋巴細(xì)胞分離液上層，勿打亂分離層，離心（2000r/min，15min）后，吸出淋巴細(xì)胞層，加入4mL Hanks’液，混勻，離心（2000r/min，10min），吸去上清，沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次后，加入RPMI-1640重懸淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。

2.4.3 T/B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測(cè)定 以ConA及LPS為刺激原，分別刺激T、B淋巴細(xì)胞引起增殖反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)其增殖反應(yīng)能力。具體方法：取1×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液100μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，12h后再加入含ConA/LPS的RPMI-1640培養(yǎng)液 100μL（ConA終濃度為 5μg/mL，LPS終濃度為10μg/mL），同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（加入不含ConA/LPS的完全培養(yǎng)液 100μL），每份作 3 個(gè)復(fù)孔。置 5%CO2、37℃孵育 48h，培養(yǎng)結(jié)束前 4h，每孔再加入 CCK-8，10μL（5mg/mL），振蕩 1min，繼續(xù)孵育4h。取出培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀上機(jī)，450nm測(cè)OD值，結(jié)果以刺激指數(shù)表示。刺激指數(shù)SI=刺激孔（加ConA/LPS孔）OD值/對(duì)照孔OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間多重比較，根據(jù)方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Tambane’s T2法進(jìn)行兩兩比較。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠外觀行為學(xué)改變 模型組小鼠精神倦怠，飲食尚可，體重略降，全身皮毛有浸濕現(xiàn)象，浸濕面積在1/3到2/3之間，皮毛灰暗欠光澤，遺留水盒污漬，逃避反應(yīng)降低；模型自然恢復(fù)組小鼠狀態(tài)稍好于模型組，體重有所增加，但全身皮毛欠光澤，仍遺留有灰暗污漬。維康顆粒干預(yù)組小鼠精神活動(dòng)自如，體重增加，體型飽滿，皮毛恢復(fù)光澤；正常對(duì)照組未見明顯異常。

3.2 各組力竭游泳時(shí)間比較 如表1所示。造模后，模型組力竭游泳時(shí)間較正常對(duì)照組明顯減少，有顯著性差異；維康顆粒干預(yù)組較模型組力竭游泳時(shí)間顯著增加（P＜0.05），且與正常對(duì)照組比較無顯著性差異（P=0.764）；模型自然恢復(fù)組游泳時(shí)間雖較模型組增加，但明顯低于維康顆粒干預(yù)組及正常對(duì)照組（P＜0.05）。提示維康顆粒干預(yù)可促進(jìn)疲勞型亞健康小鼠體力的恢復(fù)。

表1 實(shí)驗(yàn)各組力竭游泳時(shí)間比較

3.3 各組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)變化 模型組胸腺指數(shù)較正常對(duì)照組明顯降低（P=0.000）。經(jīng)維康顆粒干預(yù)及自然恢復(fù)后小鼠胸腺指數(shù)有恢復(fù)趨勢(shì)，但模型自然恢復(fù)組仍低于正常對(duì)照組（P＜0.05），而維康顆粒干預(yù)組則恢復(fù)到正常范圍，與正常對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。模型組脾臟指數(shù)明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05），維康顆粒干預(yù)組的脾臟指數(shù)與正常對(duì)照組比較無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠脾臟及胸腺指數(shù)比較

3.4 各組小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)比較 模型組T、B淋巴細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)刺激原刺激后刺激指數(shù)較正常對(duì)照組明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；而與模型組比較，維康顆粒干預(yù)組小鼠 T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)及模型自然恢復(fù)組T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)有明顯增加趨勢(shì)（P＜0.05，P＜0.01），且前者基本恢復(fù)到正常水平（P＞0.05），而模型自然恢復(fù)組T、B細(xì)胞增殖能力雖有所恢復(fù)，但仍低于正常對(duì)照組及維康顆粒干預(yù)組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖反應(yīng)比較

4 討論

疲勞型亞健康是以長(zhǎng)時(shí)間疲勞（即亞疾病性疲勞或亞臨床性疲勞）為中心表現(xiàn)的癥狀群，癥狀包括疲倦乏力、周身不適、反應(yīng)適應(yīng)能力下降等，且需排除由疾病引起的上述表現(xiàn)。本課題組以及國(guó)內(nèi)其他研究人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)，疲勞型亞健康的現(xiàn)患率約為17.6%～50.0%不等[3-4]，研究疲勞型亞健康防治具有非常重要的意義。免疫系統(tǒng)是人體重要的防御系統(tǒng)，具有免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫穩(wěn)定的功能，在人體健康中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。胸腺和脾臟作為機(jī)體重要的免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟的重要場(chǎng)所。T、B淋巴細(xì)胞作為免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，主要參與介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫，二者協(xié)調(diào)作用對(duì)維持機(jī)體正常免疫功能發(fā)揮有重要意義。研究表明身心壓力過大、過度勞累、生活作息不規(guī)律等因素容易導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常[5-7]，而調(diào)查結(jié)果顯示上述因素恰恰與疲勞型亞健康的發(fā)生關(guān)系密切[8-9]，因此推測(cè)疲勞型亞健康應(yīng)當(dāng)與免疫功能異常有關(guān)。本研究結(jié)果表明，疲勞型亞健康模型小鼠的胸腺、脾臟體積減小，重量減輕，胸腺及脾臟指數(shù)也顯著下降，提示疲勞型亞健康小鼠存在免疫功能下降的情況。進(jìn)一步通過CCK-8法檢測(cè)T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)模型小鼠的T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)明顯降低，尤其以T淋巴細(xì)胞更為明顯，同樣證明免疫功能異常與疲勞型亞健康有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)在疲勞型亞健康的防治方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前認(rèn)為情志失調(diào)、飲食不節(jié)、起居失常、勞倦內(nèi)傷、年老體衰導(dǎo)致臟腑氣血陰陽(yáng)失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致疲勞型亞健康的發(fā)生。課題組應(yīng)用中醫(yī)理論并結(jié)合多年臨床實(shí)踐，研制出防治疲勞型亞健康的中藥復(fù)方——維康顆粒。它由古方六味地黃丸加減化裁而來，可調(diào)補(bǔ)臟腑氣血，補(bǔ)而不滯，滋而不膩。臨床研究證實(shí)，維康顆粒干預(yù)疲勞型亞健康有顯著療效（總有效率約為93%），且安全性好[10]。同時(shí)藥理研究表明，熟地、山藥、黨參等藥物的提取物多糖可以提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫功能[11-12]。本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)維康顆粒不僅可以緩解模型小鼠的疲勞狀態(tài)，還可以提高小鼠的脾臟及胸腺指數(shù)，增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力，從而增強(qiáng)模型小鼠的免疫功能狀態(tài)，且其干預(yù)效果優(yōu)于模型自然恢復(fù)組，提示維康顆粒在干預(yù)疲勞型亞健康，糾正其免疫功能異常方面有確切療效。

[1]孫曉敏，魏敏，朱春燕，等.廣東地區(qū)亞健康狀態(tài)的流行病學(xué)調(diào)查研究.山東醫(yī)藥，2008，48（4）：59

[2]劉艷艷，程靜茹，余克強(qiáng)，等.疲勞型亞健康小鼠模型的研制.廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（1）：21

[3]邱玉明，賴名慧，趙曉山，等.公務(wù)員疲勞型亞健康二級(jí)干預(yù)方案的研究.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32（10）：1331

[4]潘海林.城市在校大學(xué)生疲勞性亞健康狀況調(diào)查.湖北廣播電視大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（10）：155

[5]Takahashi T，Yu F，Zhu SJ，et al.Beneficial effect of brewers yeastextract on daily activity in a murine model of chronic fatigue syndrome.Evid Based Complement Alternat Med，2006，3（1）：109

[6]Scott S，Michael A，Mary F，et al.Impaired natural immunity cognitive dysfunction，and physical symptoms in patients with chronic fatigue syndrome：preliminary evidence for a subgroup.Psychosomatic Research，2006（60）：559

[7]Fotis K，Maria B，George V.Cytokines and pathological sleep.sleep Medicine，2008（9）：603

[8]姚菊峰，付菊芳，孫靜，等.亞健康危險(xiǎn)因素及其護(hù)理干預(yù).解放軍護(hù)理雜志，2008，25（6B）：41

[9]謝雁鳴，劉保延，樸海垠，等.基于臨床流行病學(xué)調(diào)查的亞健康人群一般特征的探析.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（7）：612

[10]孫曉敏，余克強(qiáng)，李玉萍，等.維康顆粒干預(yù)亞健康狀態(tài)的療效及安全性.山東醫(yī)藥，2010，50（25）：70

[11]徐增萊，汪瓊，趙猛，等.淮山藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（5）：1040

[12]李發(fā)勝，徐恒瑰，李明陽(yáng)，等.熟地多糖提取物對(duì)小鼠免疫活性影響.中國(guó)公共衛(wèi)生，2008，24（9）：1109