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    益骨口服液對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥血瘀病機(jī)微觀分子的影響

    2013-03-29 03:40:32朱胤晟姚新苗呂一
    江蘇中醫(yī)藥 2013年5期
    關(guān)鍵詞:糖蛋白內(nèi)皮素口服液

    朱胤晟 姚新苗 呂一

    (1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,浙江 杭州 310005)

    骨質(zhì)疏松是以骨量丟失,骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征,以致骨的脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性骨骼疾病[1]。前期實(shí)驗(yàn)我們已證實(shí)益骨口服液能促進(jìn)成骨細(xì)胞(OB)的增殖。中醫(yī)認(rèn)為“腎虛”與“血瘀”是骨質(zhì)疏松癥的主要病機(jī),因此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)從血瘀的角度,通過對(duì)血漿內(nèi)皮素(ET)、血小板膜糖蛋白CD62p、CD63指標(biāo)的觀察,研究益骨口服液對(duì)骨質(zhì)疏松癥模型大鼠血瘀病理狀態(tài)的干預(yù)作用,觀察補(bǔ)腎活血方益骨口服液在補(bǔ)腎益骨的基礎(chǔ)上還可能具有的活血化瘀功效。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 藥物和器材 益骨口服液(由補(bǔ)骨脂10g,骨碎補(bǔ)15g,生地 15g,仙靈脾 15g,淮山藥 15g,丹參 30g組成),制成濃縮水提液,含生藥量1.0g/mL,用于大鼠灌胃治療,由浙江省中醫(yī)院中藥房提供。氯氨酮,上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第 001064號(hào)。大鼠內(nèi)皮素(ET-1)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,美國R&D公司生產(chǎn)。試劑單抗CD62p-PE、CD63-FITC,由Biopool生物有限公司提供。ELITE型流式細(xì)胞儀:采用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)。密蓋息:瑞士諾華制藥有限公司,注冊(cè)證號(hào):H20090459。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5月齡雌性SD大鼠80只,體重(200±10)g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)20080016,常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng),控制室溫在(21±1)℃,濕度 63%,噪音<55 分貝,光照與黑暗時(shí)間為每12h交替。

    1.3 造模 以氯胺酮按0.1g/kg腹腔麻醉后,行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。術(shù)后3d肌注青霉素4×10U,預(yù)防感染。

    1.4 給藥 造模術(shù)后將SD大鼠以常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周,第13周起開始每日給藥。益骨口服液組予益骨口服液10mL/kg,含生藥量1.0g/mL,每日2次灌胃;密蓋息組予密蓋息1.04U/kg肌肉注射,每周治療2次;益骨口服液+密鈣息組,用量用法同上2組;生理鹽水對(duì)照組予生理鹽水10mL/kg,每日2次灌胃。各組均給藥90d。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 血漿內(nèi)皮素含量測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定,在末次給藥后禁食12h,從腹主動(dòng)脈取血,注入含10%EDTA二鈉30μL和抑肽酶 20μL的試管中, 混勻,4℃,300r/min離心10min,分離血漿,置于-20℃保存,分批測(cè)定。

    1.5.2 血小板膜糖蛋白CD62p、CD63含量測(cè)定 采用單克隆抗體流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。具體方法如下:取血,抗凝,800r/min離心5min,取上層富含血小板的血漿(PRP),3500r/min離心15min,棄上清,加入 PBS 2mL,3000r/min 離心 10min,洗滌 2次,用1%多聚甲醛1.5mL室溫固定30min。將固定后的血小板懸液2500r/min離心10min,棄上清,分別加入熒光標(biāo)記的CD62p、CD63特異性抗體 2mL,置室溫 30min,2500r/min離心10min,棄上清,加入1mL PBS將血小板懸浮。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以()表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    各組大鼠治療后血漿內(nèi)皮素,血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的含量變化見表1。

    表1 各組大鼠治療后血漿內(nèi)皮素、CD62p、CD63含量() ng/L

    表1 各組大鼠治療后血漿內(nèi)皮素、CD62p、CD63含量() ng/L

    注:與生理鹽水對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與密蓋息組比較,#P<0.05,##P<0.01;

    3 討論

    骨質(zhì)疏松癥可導(dǎo)致因骨的脆性增高而骨折,骨折不可避免地會(huì)損傷血竇,致骨內(nèi)瘀血。由于容積增加而使骨內(nèi)壓升高,導(dǎo)致骨痛。以往對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療以腎主骨為根本指導(dǎo)思想,對(duì)本病的認(rèn)識(shí)也多停留在補(bǔ)腎這一單一層面上[2]。而現(xiàn)代認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥是在腎虛的基礎(chǔ)上導(dǎo)致血瘀,尤其重視了瘀血在骨質(zhì)疏松癥病因病機(jī)中的作用[3]。而血瘀證的本質(zhì)與微循環(huán)障礙密切相關(guān),雖然目前國外文獻(xiàn)尚未報(bào)道關(guān)于血瘀的概念,也無法從血瘀來探討原發(fā)性骨質(zhì)疏松,但有很多文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松與微循環(huán)改變關(guān)聯(lián)的研究[4],這些微觀改變與中醫(yī)學(xué)血瘀證分子生物學(xué)研究有極大的相關(guān)性。認(rèn)為血瘀的形成與血液成分、血流狀態(tài)、血管壁等病理變化密切相關(guān)[5]。

    中醫(yī)認(rèn)為血的運(yùn)行必須依賴氣的推動(dòng),氣虛無以推動(dòng)血行必定成瘀,表明血瘀證除了與“血行”有關(guān)外,還與血液本身成分的改變有關(guān)。目前血小板活化因子是血瘀證血液成分改變的研究熱點(diǎn)[6]。近年研究認(rèn)為,CD62p、CD63都是活化血小板膜糖蛋白,分別存在于靜息血小板的a-顆粒內(nèi)及溶酶體膜,當(dāng)血小板被激活時(shí),血小板內(nèi)顆粒與血小板膜整合,CD62p、CD63表達(dá)于血小板表面,是目前所知的反映血小板活化與釋放反應(yīng)最特異性的標(biāo)志物。內(nèi)皮細(xì)胞的存在為維持血液的流動(dòng)狀態(tài)所必需,它的損傷是血管病變的始動(dòng)因子。近年發(fā)現(xiàn)的低分子ET,是具有細(xì)胞信使樣作用的生活活性物質(zhì)。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)ET對(duì)微循環(huán)血管的功能和結(jié)構(gòu),對(duì)血細(xì)胞的聚集和黏附都有顯著的影響,已被視為血瘀證嚴(yán)重程度的指標(biāo)[7]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在給藥90d后,與生理鹽水對(duì)照組比較,益骨口服液能降低去勢(shì)大鼠血漿血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的水平,降低血漿內(nèi)皮素的含量。通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及血小板膜糖蛋白的檢測(cè),從微觀分子生物學(xué)角度,說明補(bǔ)腎活血方益骨口服液能改變骨質(zhì)疏松“血瘀”病理狀態(tài)下的客觀性變化。

    到目前為止,關(guān)于血瘀與骨質(zhì)疏松癥直接相關(guān)的系統(tǒng)研究很少,筆者認(rèn)為,中醫(yī)藥復(fù)方研究防治骨質(zhì)疏松癥,應(yīng)綜合運(yùn)用多靶點(diǎn)、多途徑的研究渠道[8]。本研究是以內(nèi)皮素和血小板膜化蛋白為突破點(diǎn),從“血瘀”立論,豐富了“腎虛”致病理論,從“血瘀”的病理本質(zhì)出發(fā),對(duì)以后更深入研究中醫(yī)補(bǔ)腎活血法治療骨質(zhì)疏松癥提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    [1]劉忠厚.骨質(zhì)疏松學(xué).北京:科學(xué)出版社,1998:529

    [2]張?chǎng)?,肖魯偉,童培建,?補(bǔ)腎活血湯防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究.中國正骨,2010,2(22):83

    [3]楊林,姚新苗,黃競(jìng),等.補(bǔ)腎益骨方對(duì)去勢(shì)大鼠血生化、骨量和骨力學(xué)性能的影響.中國骨傷,2007,4(22):224

    [4]眭承志,陳少玫,程火生,等.絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥血瘀病機(jī)的微觀分子生物學(xué)論證.中醫(yī)研究,2005,4(18):21

    [5]吳其夏.體液因素和血液循環(huán)病理生理學(xué).北京:北京醫(yī)科大學(xué),中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1991:126

    [6]眭承志,范燕妮.老年性骨質(zhì)疏松血瘀病機(jī)的微觀分子生物學(xué)研究.中國骨質(zhì)疏松雜志,2010,5(16):325

    [7]王靜,張?zhí)m,張家慶,等.雌激素對(duì)血漿內(nèi)皮素水平的影響.中華內(nèi)分泌代謝雜志,1996,12(1):46

    [8]黃宏興,陳彥東.中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松癥的研究思路和方法.中醫(yī)正骨,2008,20(3):74

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