異氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠離體心臟保存效果的影響

李 鐳，梁智星，梁法禹

缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IP）已經(jīng)在動(dòng)物試驗(yàn)中得到驗(yàn)證［1］，但臨床實(shí)踐中很難充分應(yīng)用。異氟烷作為常用的全身麻醉藥已經(jīng)在臨床上得到普遍應(yīng)用。本文就異氟烷預(yù)處理后心肌功能的變化進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和動(dòng)物 異氟烷（isoflurane）：山東科源制藥有限公司（山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所制藥廠）；肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒：長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；K-H緩沖液（Krebs-Henseleit buffer solution，KHB）、心臟保存液為HTK液：北京榮生醫(yī)藥科技發(fā)展中心；SD大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 離體大鼠心臟模型的建立 成年SD大鼠36只，雌雄各半，體重270 g～320 g（6周齡～8周齡），腹腔注射肝素（3 mg／kg）和戊巴比妥鈉（65 mg／kg），仰臥位，開(kāi)胸，于升主動(dòng)脈和頭臂干近端切斷主動(dòng)脈和上腔靜脈，切斷下腔靜脈，肺動(dòng)脈分叉前切斷肺動(dòng)脈，取出心臟，迅速放入0℃～4℃K-H緩沖液中，沖洗出心臟內(nèi)殘留血液，并移至Langendorff灌注裝置上，經(jīng)主動(dòng)脈灌注K-H液，根據(jù)大鼠正常生理血壓范圍，設(shè)定灌注壓為80 mm Hg～100 mm Hg，灌注液溫度維持35℃～37℃，鼠心周圍溫度在34℃～36℃。整個(gè)灌注期間用95%O2和5%CO2混合氣體飽和K-H液。肺動(dòng)脈根部切開(kāi)，充分引流冠狀靜脈回流液。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)掌握切取技術(shù)后，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)開(kāi)胸取心至灌注開(kāi)始控制在1 min內(nèi)完成。穩(wěn)定3 min～5 min后切開(kāi)心耳，經(jīng)左心房、二尖瓣，將連接測(cè)壓導(dǎo)管的球囊送入左心室，測(cè)壓導(dǎo)管的另一端連接多導(dǎo)生理記錄儀。向心室球囊內(nèi)緩慢注射適量生理鹽水（55μL～70μL），使左室舒張末壓維持在10 mmHg～12 mm-Hg。平衡20 min后，心臟搏動(dòng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)值并留取冠脈流出液標(biāo)本。

1.2.2 灌注及低溫保存方法（HTK保存液） 連續(xù)灌注K-H液平衡30 min后，經(jīng)主動(dòng)脈根部單次灌注4℃的HTK液，灌注劑量為30 m L／kg，灌注時(shí)間為2 min，心臟表面同時(shí)降溫，心臟停搏后置于HTK液中保存。在4℃條件下分組保存4 h、6 h和8 h，保存期間不進(jìn)行重復(fù)灌注。保存結(jié)束后重新將鼠心移至Langendorff裝置上灌注K-H液，逐漸復(fù)溫至37℃，使心臟復(fù)跳，并持續(xù)灌注30 min，測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并留取冠脈流出液測(cè)量心肌酶。

1.3 選擇心臟的標(biāo)準(zhǔn) 離體心臟經(jīng)Langendorff裝置平衡灌注15 min后，心率（HR）＜200次／min，左室收縮壓（LVSP）＜75 mm Hg，早搏＞2次／min，舍棄不用。4 h組、6 h組中共有3只大鼠退出實(shí)驗(yàn)，后續(xù)試驗(yàn)補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)例數(shù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 采用完全隨機(jī)分組，根據(jù)造模前是否使用異氟烷預(yù)處理，將36只大鼠分為兩組，每組18只。實(shí)驗(yàn)組：造模前2 d，每天腹腔注射異氟烷原液3 m L／kg。對(duì)照組：造模前2 d，每天腹腔注射生理鹽水3 m L／kg。之后再根據(jù)保存時(shí)間，各分為4 h組、6 h組、8 h組，每組6只。保存后6 h組1只大鼠，8 h組2只大鼠離體心不復(fù)跳，退出實(shí)驗(yàn)，后續(xù)補(bǔ)齊例數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各項(xiàng)心功能指標(biāo)以復(fù)灌穩(wěn)定后測(cè)得與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始基礎(chǔ)值的百分比表示。采用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響 隨著離體心臟保存時(shí)間的增長(zhǎng)，心功能指標(biāo)恢復(fù)率（復(fù)灌穩(wěn)定后測(cè)得指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始基礎(chǔ)值之比，以百分比表示）逐漸降低。實(shí)驗(yàn)組4 h、6 h與對(duì)照組比較，心功能指標(biāo)恢復(fù)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），8 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，心功能各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示異氟烷預(yù)處理可以改善離體心臟低溫保存效果，但在冷保存6 h以內(nèi)無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)表1。

表1 不同保存時(shí)間再灌注30 min后心功能指標(biāo)恢復(fù)率（±s） %

表1 不同保存時(shí)間再灌注30 min后心功能指標(biāo)恢復(fù)率（±s） %

注：LVEDP為左心室舒張末壓；LVDP為左心室舒張壓；LVSP為左心室收縮壓；＋dp／dtmax為左心室最大壓力上升速率；-dp／dtmax為左心室最大壓力下降速率。與對(duì)照組同時(shí)間比較，1）P＜0.05

組別 n LVEDP LVDP LVSP ＋dp／dtmax -dp／dtmax實(shí)驗(yàn)組 4 h 6 89.20±3.12 86.70±16.41 84.74±4.60 90.03±13.45 90.73±14.51 6 h 6 80.45±3.58 84.34±12.71 80.22±5.51 86.31±11.75 84.76±12.22 8 h 6 61.42±4.221） 66.89±15.121） 75.01±4.811） 71.63±9.851） 68.83±10.141）對(duì)照組 4 h 6 88.45±4.45 87.41±12.61 86.40±3.31 91.21±11.32 91.05±12.52 6 h 6 81.44±4.24 86.35±14.71 82.21±3.13 88.64±13.35 87.85±10.06 8 h 6 67.57±6.90 60.36±14.32 65.22±2.61 67.30±11.43 72.70±12.75

2.2 冠脈流出液中CK、LDH含量的影響 離體心臟保存前取各組平衡灌注冠脈流出液基礎(chǔ)值，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著離體心保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組心肌酶CK、LDH均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組4 h、6 h與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組8 h與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

3 討 論

缺血預(yù)處理是在首次一定時(shí)間缺血后對(duì)再次缺血的耐受力提高現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在臨床上心肌缺血及缺血再灌注方面具有實(shí)用價(jià)值，但人工造模生成缺血在臨床上無(wú)法進(jìn)行，應(yīng)用藥物提高缺血閾值（藥物預(yù)處理，APC）即成為臨床醫(yī)生的期望，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行探討。

缺血預(yù)處理的保護(hù)作用可分為兩個(gè)時(shí)相，即早期保護(hù)（early phaseof protection，EP），指心肌在預(yù)處理后其抗損傷的能力立即明顯增強(qiáng)，約可持續(xù)1 h～3 h。二是延遲保護(hù)（delayed phase of protection，DP），指預(yù)處理后24 h再次出現(xiàn)的抗損傷能力，這是心肌的亞急性適應(yīng)保護(hù)反應(yīng)，出現(xiàn)后約可持續(xù)2 d～3 d。上述二者之間不存在連續(xù)過(guò)程。即預(yù)處理后馬上出現(xiàn)抗損傷能力，2 h～4 h后消失，24 h后又出現(xiàn)，持續(xù)2 d～3 d后消失?，F(xiàn)有研究認(rèn)為［2］，EP的抗損傷能力是激活機(jī)體現(xiàn)有的各種抗損傷效應(yīng)子，因此出現(xiàn)快、持續(xù)時(shí)間短。而DP抗損傷能力是機(jī)體通過(guò)抗損傷基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生新的抗損傷效應(yīng)子，二者之間的中斷過(guò)程就是新的抗損傷效因子的產(chǎn)生過(guò)程。因此，DP的起效慢、作用時(shí)間長(zhǎng)。

EP減少心肌梗死面積的能力比DP強(qiáng)［3］。但DP不僅能減少心肌梗死面積，而且能抗心律失常［4］和心肌頓抑（Stuning）［5］。EP不能反復(fù)刺激出現(xiàn)［6］，即在長(zhǎng)時(shí)間缺血再灌注前，不論給予多少次的預(yù)處理，其抗損傷能力不能加強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間也不會(huì)延長(zhǎng)。而DP可以反復(fù)刺激出現(xiàn)［7］，即在長(zhǎng)時(shí)間缺血再灌注前24 h給予預(yù)處理產(chǎn)生抗損傷能力，2 d～3 d后再給予預(yù)處理，其抗損傷能力仍可出現(xiàn)。有資料表明反復(fù)DP處理可使心肌的抗損傷能力持續(xù)10 d［8］。因此，DP比EP有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。假設(shè)在供心保存前馬上給予心臟預(yù)處理，其抗損傷能力僅能在術(shù)中體現(xiàn)，保存后沒(méi)有體現(xiàn)。而在供心保存前24 h給予預(yù)處理，心肌的抗損傷能力在術(shù)中及整個(gè)供心保存期間均能體現(xiàn)。

吸入麻醉藥是一類對(duì)心肌可以產(chǎn)生負(fù)性變力的藥物，臨床應(yīng)用因其降低心肌耗氧量，從而對(duì)心肌有一定類似IP的保護(hù)作用［9，10］。本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff立體心臟灌注模型，排除了神經(jīng)、體液因素和心臟前、后負(fù)荷的影響。以目前臨床常用吸入麻醉藥-異氟烷進(jìn)行心肌藥物預(yù)處理，且在實(shí)驗(yàn)前24 h給藥，使藥物完全代謝，排除異氟烷本身直接的抗心肌缺血效應(yīng)。更加確切了異氟烷的藥物預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。目前麻醉藥物除應(yīng)用于麻醉、疼痛治療和ICU使用外，尚無(wú)其他的臨床治療作用，麻醉藥物預(yù)處理的研究為麻醉藥物的應(yīng)用開(kāi)辟了一個(gè)新的方向。

LVEDP、-dp／dtmax是反映出左心室舒張期順應(yīng)性及心肌保存后僵硬程度的指標(biāo)之一，其中LVEDP在評(píng)價(jià)缺血再灌注損傷方面比LVDP更為敏感［11］，所以在低溫保存供心后再灌注過(guò)程中，動(dòng)態(tài)觀察左室功能中加入LVDEP的變化用來(lái)判斷心肌損傷程度。實(shí)驗(yàn)中，置入左心室的水囊體積恒定，因而水囊內(nèi)的壓力變化可以反映LVEDP的變化，測(cè)量出左心室的順應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫保存8 h，各項(xiàng)心功能指標(biāo)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均明顯改善，但保存4 h與6 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8 h實(shí)驗(yàn)組復(fù)灌后心功能指標(biāo)LVDP、LVSP、＋dp／dtmax明顯好于對(duì)照組，表明異氟烷預(yù)處理可以提高收縮功能；LVEDP、-dp／dtmax上升程度8 h實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，表明異氟烷可以改善再灌注后心肌舒張功能，降低心肌僵硬程度。根據(jù)以上心功能指標(biāo)可以看出異氟烷預(yù)處理可以提高低溫保存8 h的離體心功能，但對(duì)于低溫保存6 h以內(nèi)離體心功能無(wú)明顯影響。

因?yàn)樵俟嘧p傷和細(xì)胞膜通透性增高，心肌中豐富的酶大量漏出，致使冠脈流出液中心肌酶濃度升高，酶學(xué)指標(biāo)水平與細(xì)胞壞死量密切相關(guān)，從其水平有助于判斷心肌細(xì)胞損傷程度［12］。本實(shí)驗(yàn)中，冷保存后心肌酶均有不同程度升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，心肌酶升高越加明顯。8 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間心肌酶CK、LDH升高程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示異氟烷可以減輕再灌注心肌細(xì)胞的損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示異氟烷在8 h組具有心肌保護(hù)作用，這與冷保存離體心臟特點(diǎn)有關(guān)，相關(guān)文獻(xiàn)指出［13］，冷保存8 h是心肌能量?jī)?chǔ)存急劇下降，心功能顯著減退的關(guān)鍵階段，HTK液在6 h內(nèi)心肌保護(hù)效果好，雖然各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)有輕度下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，超過(guò)6 h保存效果下降明顯。目前臨床上常用的單次灌注低溫保存是一種安全、簡(jiǎn)單而且經(jīng)濟(jì)的方法，國(guó)際公認(rèn)此法保存心臟時(shí)限一般在4 h～5 h，但國(guó)外有報(bào)道，認(rèn)為供體心臟保存8 h以上已經(jīng)不再是心臟移植的禁忌證［14］，國(guó)內(nèi)也報(bào)道了3例供心離體保存6 h～9 h后行心臟移植獲得成功的病例［15］。而本實(shí)驗(yàn)異氟烷在心臟離體保存8 h中的心肌保護(hù)作用，恰好為超過(guò)一般保存時(shí)限的心臟移植提供了幫助，具有臨床實(shí)踐意義。

本實(shí)驗(yàn)未能對(duì)冷保存時(shí)間大于8 h進(jìn)行觀察，且對(duì)異氟烷具體預(yù)處理影響的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)采用異氟烷預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)組在缺血前采用腹腔注射實(shí)驗(yàn)劑量的異氟烷，經(jīng)24 h取離體心臟進(jìn)行冷保存后心功能指標(biāo)恢復(fù)情況，通過(guò)測(cè)定心肌酶及心肌力學(xué)指標(biāo)，評(píng)價(jià)異氟烷的作用效果，結(jié)果顯示在腹腔預(yù)先注射異氟烷后，冷保存8 h心臟恢復(fù)較佳。

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