BRAF基因與甲狀腺癌分子診療的研究進(jìn)展

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【摘要】 對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查，給臨床醫(yī)生診斷甲狀腺腫瘤提供了一個(gè)新的信息。該技術(shù)在甲狀腺癌的臨床診斷中，特別是BRAF基因的應(yīng)用，在一定程度上提高了甲狀腺癌診療水平。國內(nèi)外最新研究表明，BRAF基因檢測為甲狀腺癌的診斷和預(yù)后提供了參考，并給臨床上甲狀腺癌的初始化治療指明了一個(gè)方向。對(duì)于臨床細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測不能確定的甲狀腺癌，BRAF分子檢測技術(shù)可作為一個(gè)有用的檢測手段，為臨床診斷甲狀腺癌提供一個(gè)決定性的參考，使更多的甲狀腺癌患者得到個(gè)體化的治療。本文就BRAF基因與甲狀腺癌分子診療的關(guān)系進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 BRAF； 細(xì)胞學(xué)； 分子診斷； 甲狀腺癌

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，甲狀腺癌來自濾泡或者濾泡旁細(xì)胞。濾泡源性腫瘤最普遍存在于甲狀腺癌中，包括乳頭狀癌、卵泡癌和嗜酸性細(xì)胞癌。這些分化型甲狀腺癌占所有甲狀腺惡性腫瘤的95%[1]。過去幾十年里整個(gè)西方世界甲狀腺癌的發(fā)病率在增加。我國甲狀腺癌的發(fā)病率由10/100萬升到約30/100萬～40/100萬；而美國則增長了300%，乳頭狀癌大概占所有甲狀腺癌的80%～90%[2]。臨床上診斷甲狀腺癌的方法非常多，如細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查、PET/CT、DNA測序熒光原位雜交、PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)PCR以及單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR等，在一定程度上都能對(duì)甲狀腺癌的診斷提供幫助，但在準(zhǔn)確率上存在一定的假陰性。最近的研究表明，對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行BRAF基因的檢測對(duì)于排除或診斷甲狀腺癌具有重要的臨床意義。由此可見，BRAF基因的檢測在甲狀腺癌的臨床診斷中扮演著至關(guān)重要的作用。以下就臨床上對(duì)甲狀腺癌診斷具有重要作用的檢測方法進(jìn)行闡述。

1 細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查在甲狀腺癌診斷中的局限性

1.1 細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查的局限性 甲狀腺結(jié)節(jié)為臨床上常見的甲狀腺疾病，但僅有5%的甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)展為惡性腫瘤。術(shù)前通過對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測是目前診斷甲狀腺腫瘤的一個(gè)較好的診斷方法。是使用細(xì)針及針管，刺入病變區(qū)域內(nèi)，通過提插等方式將病灶內(nèi)的細(xì)胞或小組織塊切割下來，同時(shí)借助針管內(nèi)負(fù)壓將其吸出，涂片及染色后在光鏡下閱片，最后完成病理診斷的一種活檢方法。其目的主要為診斷是否腫瘤、良惡性及類型，已成為腫瘤確診的主要手段之一，尤其是近10年來影像技術(shù)的發(fā)展，在B超引導(dǎo)下，應(yīng)用細(xì)針穿刺對(duì)淺表腫塊，如乳腺、甲狀腺、淋巴結(jié)等進(jìn)行細(xì)胞學(xué)活檢，是早期診斷腫瘤的最快捷、簡便與安全的方法。研究表明，對(duì)穿刺出的組織樣本進(jìn)行分子生物學(xué)檢測可明顯提高該疾病細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確度[3]，但其仍存在一定的局限性，主要包括以下幾個(gè)方面：（1）不能從良性配對(duì)物中分辨卵泡狀細(xì)胞癌還是嗜酸性細(xì)胞腺癌；（2）有造成惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的可能性；（3）穿刺為有創(chuàng)性的檢查，可能會(huì)損傷血管或神經(jīng)等；（4）穿刺不到位，有可能導(dǎo)致陰性結(jié)果的出現(xiàn)，從而延誤疾病的診療時(shí)機(jī)。

1.2 貝塞斯達(dá)甲狀腺細(xì)胞穿刺分級(jí)系統(tǒng)在甲狀腺癌診斷中的作用 為了指出細(xì)胞穿刺的診斷局限性，這個(gè)分級(jí)系統(tǒng)提出了以下幾種分類：不符合要求的、良性、惡性、不確定惡性腫瘤的、非典型和可疑性腫瘤的。這些分類最近已在一個(gè)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)被前瞻性的測試過[4]。學(xué)者們?cè)谝荒陜?nèi)收集了3207例甲狀腺結(jié)節(jié)，評(píng)估發(fā)現(xiàn)這些病例中不符合要求的有11.1%，良性73.8%，惡性5.2%，不確定惡性腫瘤的9.8%：其中包括5.5%濾泡性腫瘤/許萊特細(xì)胞腫瘤，3%非典型和1.3%可疑性腫瘤。378例患者接受了外科手術(shù)，有2.2%的假陽性率。貝塞斯達(dá)系統(tǒng)作為所有腫瘤的篩選方式，其特異性為68%，而作為惡性腫瘤的診斷方式其特異性為93%。還有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，不確定惡性腫瘤中的惡性風(fēng)險(xiǎn)：非典組17%，濾泡性腫瘤25.4%，可疑性腫瘤組為70%[5]。這些結(jié)果說明，即使沒有對(duì)穿刺出的組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測，可疑性腫瘤組的惡性風(fēng)險(xiǎn)非常高，需要引起?？漆t(yī)生的重視[4-5]。關(guān)于分子診斷，國家癌癥研究所的建議中明確規(guī)定：鑒于目前有限的證據(jù)，進(jìn)一步的研究應(yīng)適應(yīng)臨床使用的需要[6]。

2 分子檢測技術(shù)在診斷甲狀腺癌中的作用

能檢測各種標(biāo)本分子突變的生物技術(shù)在臨床檢測中被廣泛應(yīng)用，這些標(biāo)本不僅限于血液、唾液試紙、新鮮的冰凍組織、細(xì)針穿刺組織，還包括福爾馬林固定石蠟包埋的組織。當(dāng)今臨床實(shí)驗(yàn)室常見的分子分析技術(shù)包括DNA測序熒光原位雜交、PCR以及一些改良的分子檢測技術(shù)，如逆轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR。沈樑等[7]對(duì)21例甲狀腺癌患者應(yīng)用亞甲藍(lán)染色法行前哨淋巴結(jié)活檢（sentinel lymph-node biopsy，SLNB），對(duì)SLN進(jìn)行HE染色、細(xì)胞角蛋白19（CK19）的免疫組化染色（IHC）及RT-PCR檢測，比較三種方法對(duì)SLN微轉(zhuǎn)移灶檢出的敏感性、準(zhǔn)確率的差異。結(jié)果21例中，成功檢出SLN 16例，檢出率為76.2%。IHC、RT-PCR與HE比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明前哨淋巴結(jié)活檢可有效判斷甲狀腺癌轉(zhuǎn)移狀態(tài)，應(yīng)用RT-PCR檢測CK19在SLN中的表達(dá)，可提高敏感度及準(zhǔn)確率。

3 BRAF基因的分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能以及在甲狀腺癌診斷方面的作用

3.1 BRAF基因的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能 BRF基因，別名鼠類肉瘤濾過性毒菌（v-raf）致癌同源體B1；1988年由Ikawa等[8]首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)并將其克隆出來，是一個(gè)能對(duì)NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染且具有生物學(xué)活性的一種DNA序列；由于其與CRAF基因、ARAF基因的同源性非常的高，故又有學(xué)者將其稱為BRAF基因。BRAF基因由783個(gè)氨基酸組成，位于染色體7q34的BRAF基因能夠編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAF家族成員之一，而且還是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號(hào)通路中相當(dāng)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。BRAF基因突變引起機(jī)體患病主要是通過以下兩種途徑：（1）遺傳基因的突變而導(dǎo)致先天性缺陷疾病的途徑；（2）后天獲得致癌基因而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或形成的途徑，其生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等[9]。

3.2 BRAF基因與甲狀腺癌診斷方面的關(guān)系 BRAFFT1799A（V600E）位點(diǎn)與RAS蛋白結(jié)合后發(fā)生谷氨酸至纈氨酸的點(diǎn)突變，因而引起了MAPK通路中REK和MEK的腫瘤基因的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)[10]。迄今為止，V600E點(diǎn)突變是BRAF基因中最常見的遺傳病變，約占乳頭狀癌的45%[11]。而臨床上少見的BRAF基因K601E點(diǎn)突變和AKAP9-BRAF重組常與輻射相關(guān)的乳頭狀癌發(fā)生有關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，僅1%～2%乳頭狀癌與此突變相關(guān)[11-12]。從組織學(xué)上，BRAF顯示出對(duì)乳頭狀癌家族的局限性[11]。這在不同的濾泡性乳頭狀甲狀腺癌中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)。在低分化腫瘤中，BRAF突變?cè)絹碓蕉嗟脑谌シ只l譜從高分化焦點(diǎn)到大細(xì)胞中的低分化區(qū)域和孤立的突變和未分化癌中的每一階段被檢測到[13]。這也就為突變既在腫瘤發(fā)生起到了早期作用，也在癌癥的生物學(xué)去分化中起到作用；同樣的，BRAF也與一定的臨床因素相關(guān)，如老年患者的年齡、甲狀腺外腫瘤的轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分期、疾病的再發(fā)、再手術(shù)等[14]。

4 BRAF基因的臨床意義

BRAF基因的意義在于它不僅可作為一種診斷的手段，對(duì)預(yù)后也有一定的意義。考慮到它與一些侵襲性疾病具有相關(guān)性，許多學(xué)者提出對(duì)于BRAF陽性的甲狀腺癌患者相對(duì)于陰性的患者而言具有更強(qiáng)的侵襲性，從而在治療上需要施行甲狀腺全切術(shù)加中心淋巴結(jié)清除，術(shù)后需要更高劑量的放射性碘治療，更低的促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）抑制，并且密切隨訪。分子標(biāo)記物（如BRAF基因）有助于在細(xì)胞形態(tài)學(xué)不典型和取樣不佳的情況下做出比較有效的診斷，在細(xì)胞形態(tài)不典型和可疑時(shí)對(duì)明確腫瘤的性質(zhì)具有重要意義[15]。近期一項(xiàng)研究表明，BRAF在腫瘤中預(yù)測淋巴結(jié)的侵襲性可能與腫瘤的大小相關(guān)[16]。這項(xiàng)研究對(duì)100例為單發(fā)病灶的甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行BRAF檢測，根據(jù)這100例患者手術(shù)所切除腫瘤的大小分成三類：小于0.5 cm、0.5～1 cm、大于1 cm。盡管這三類BRAF的突變率相似，但是BRAF僅僅反映第二組的淋巴結(jié)侵襲性。這表明BRAF對(duì)亞厘米級(jí)的微型癌具有風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的意義。

5 展望

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查、免疫組化染色（IHC）及RT-PCR檢測技術(shù)等對(duì)甲狀腺癌的診斷起到了至關(guān)重要的作用。從分子生物學(xué)角度來講，甲狀腺腫瘤患者體內(nèi)存在多種分子標(biāo)記物。但在診斷上，具有明確價(jià)值的方法主要是結(jié)合外科手術(shù)前細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記物的檢測結(jié)果。另外，也發(fā)現(xiàn)在甲狀腺腫瘤患者體內(nèi)存在一些基因的改變，如BRAF基因分析作為診斷標(biāo)志已成為診斷甲狀腺腫瘤非常有效的方法，但是它對(duì)預(yù)后的作用還需進(jìn)一步的研究[3，10，14，17]。此外，一些基因的突變可能對(duì)于甲狀腺癌的預(yù)后具有重要意義，如BRAF，這使得很多人對(duì)于積極恰當(dāng)?shù)耐饪剖中g(shù)和藥物治療某些確定的甲狀腺癌的方法提出了一些質(zhì)疑[17]。因此，BRAF分子診斷為甲狀腺癌的診斷、治療和預(yù)后提供了一個(gè)新的方法，進(jìn)一步的臨床研究為日后正確治療此類疾病提供最佳的診斷方法尤其重要。未來，是否可以將其整合到甲狀腺癌的診斷和治療等各項(xiàng)工作中，值得科研人員和?？漆t(yī)生進(jìn)一步的努力。

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（收稿日期：2012-11-22） （本文編輯：陳丹云）