重組人血管內(nèi)皮抑制素抗小鼠肝癌H22作用機(jī)制探討

杜國芳　王麗紅　裴毅

【摘要】 目的：觀察重組人血管內(nèi)皮抑制素（Endostar，恩度）對小鼠肝癌H22的抗血管生成作用，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法：建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組8只。在不同時間分別對各組給藥。觀察實驗第18天小鼠腫瘤體積和微血管密度的情況。結(jié)果：實驗第18天，接種腫瘤當(dāng)天開始腹腔給藥組（B組）與對照組（D組）腫瘤體積和微血管密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）與對照組（D組）腫瘤體積和微血管密度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：單獨應(yīng)用恩度（重組人血管內(nèi)皮抑制素）有抗腫瘤作用，接種腫瘤時用藥為最佳給藥時機(jī)。

【關(guān)鍵詞】 肝癌； 治療； 恩度； 重組人血管內(nèi)皮抑制素； 小鼠； H22肝癌細(xì)胞株

近代的理論研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新生血管是腫瘤生長所必需的，實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)，腫瘤有兩種血管：即固有血管和因腫瘤細(xì)胞釋放VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）生成的新生血管，后者是腫瘤生長的決定條件。重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液（Endostar，YH-16恩度）是我國學(xué)者自主創(chuàng)新研發(fā)的新型人血管內(nèi)皮抑素，其聯(lián)合化療治療NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）有確切療效，但對其他惡性腫瘤治療的效果鮮有報道，從基礎(chǔ)研究資料看恩度的作用都指向抗血管生成，所以借助于鼠模型觀察恩度應(yīng)用后腫瘤組織的生長情況，則能為下一步確定恩度的作用機(jī)制建立研究平臺。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌H22瘤株，由中國藥品制品鑒定所引進(jìn)。4～5周齡昆明小鼠，雄性32只，平均體重19～22 g/只，由山西中醫(yī)院研究所動物室提供。

動物室室溫22～24 ℃，相對濕度40%～45%，日光燈12 h人工照明，專用鼠糧自由進(jìn)食，潔凈水自由飲用，動物實驗室為清潔級。

1.2 方法 將冷凍保存在-80 ℃冰箱中的H22肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后，注射入昆明小鼠左腋下，7 d后，腫瘤生成明顯。在無菌條件下取腫瘤，以培養(yǎng)液調(diào)整其中瘤細(xì)胞密度至1×107個細(xì)胞/ml，用注射器吸取腫瘤懸液0.2 ml注入32只4～5周齡的雄性昆明小鼠右腋下的皮下進(jìn)行接種，建立動物模型。將32只小鼠按隨機(jī)分組方法，分成A、B、C、D組，每組8只。A組開始給藥時間為實驗第1天。實驗第5天所有小鼠接種腫瘤。恩度3 mg/kg注入腹腔，1次/d，直至小鼠被處死或小鼠死亡。實驗第18天處死小鼠，留取腫瘤組織。A組于實驗第1天（接種腫瘤前）開始給藥。B組于實驗第5天（接種腫瘤日）開始給藥。C組于實驗第9天（接種腫瘤日后第4 d）開始給藥。D組對照組，只造模不給藥。眼眶取血后處死小鼠，解剖出腫瘤稱重。將全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片。免疫組化染色，抗CD34單克隆抗體標(biāo)本。實驗藥物：恩度注射液（重組人內(nèi)皮抑制素注射液）由山東先聲麥得津生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號20100303。實驗試劑：抗CD34單克隆抗體。

1.3 實驗數(shù)據(jù)收集 小鼠腫瘤指標(biāo)測定：將接種后的昆明小鼠喂養(yǎng)在清潔級動物室內(nèi)，每日使用電子天平測量各小鼠體重。從實驗第9天開始每日使用游標(biāo)卡尺測量各小鼠右腋下腫瘤大?。▎挝粸閙m），計算腫瘤體積。腫瘤體積=長徑×橫徑2/2。

1.4 染色結(jié)果判定及微血管密度的測定 CD34在光鏡下將血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)染為棕黃色。采用Weidner等提出的方法對研究結(jié)果進(jìn)行MVD量化分析。首先在40倍光鏡視野下掃視整個切片尋找血管高密度集中的區(qū)域作為“熱點”，這些區(qū)域通常位于腫瘤邊緣區(qū)域的纖維組織中。然后在100倍光鏡視野下計數(shù)微血管數(shù)目，各計數(shù)5個高倍視野，取其平均值作為該標(biāo)本的微血管數(shù)。凡單個孤立的或多個緊密排列的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，只要與鄰近腫瘤細(xì)胞及周圍結(jié)締組織成分分界清楚，不論有無血管腔，即可計數(shù)為1個微血管數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0專用統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以（x±s）表示，用單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差齊性檢驗和統(tǒng)計分析，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間的兩兩比較分析與推斷。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗第18天，接種腫瘤當(dāng)天開始給藥組（B組）與對照組（D組）腫瘤體積及微血管密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）與對照組（D組）腫瘤體積及微血管密度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

3 討論

恩度（重組人血管內(nèi)皮抑制）是我國第1個上市的血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物（恩度），在針對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）聯(lián)合化療的臨床試驗中顯示出良好的療效[1]。也有文獻(xiàn)報道，單獨用恩度治療僅3%有效，而此3%患者與其他腫瘤患者究竟是什么問題導(dǎo)致其治療效果的顯著差異，目前沒有解決。

在研究實驗中發(fā)現(xiàn)，如果抗腫瘤血管生成的治療方案確實有效，除了表現(xiàn)為腫瘤體積較小，生存時間延長外，在腫瘤的組織切片中也表現(xiàn)為血管密度明顯減少[2-3]。用CD34血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物檢測腫瘤新生血管的微血管密度（microvessel density，MVD），標(biāo)記腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞計算微血管密度（MVD）可以間接定量腫瘤血管發(fā)生情況[4]。因此本研究以此為研究方向，選用抗小鼠肝癌H22細(xì)胞株移植的腫瘤模型，在腫瘤接種的不同時間采用恩度治療，通過觀察腫瘤體積和腫瘤組織的血管密度，評價不同給藥時間恩度對腫瘤的作用，探索單用恩度療效差的原因，研究分4個組，其中觀察組3個，對照組1個，觀察組恩度用量一致，其中A組于接種腫瘤前4 d采用恩度治療，B組于接種腫瘤當(dāng)日采用恩度治療，C組與接種腫瘤后4 d用恩度，三個觀察組中腫瘤體積和腫瘤組織血管密度與對照組比較，表1的研究結(jié)果表明：恩度治療后從腫瘤體積和血管密度觀察，恩度于腫瘤接種當(dāng)天應(yīng)用顯示出恩度的治療效果，與對照組相比二者均P<0.05，而恩度在腫瘤接種前和腫瘤接種后應(yīng)用與對照組相比都不能使腫瘤血管密度和瘤體積發(fā)生變化（P>0.05）?；A(chǔ)研究認(rèn)為：恩度作用于新生血管內(nèi)皮的“爬行”，即腫瘤新生血管生成的“結(jié)果”階段，而腫瘤的生長需經(jīng)兩個階段，即無血管期和血管產(chǎn)生后的快速增殖期[5]，因此本研究的結(jié)論可以認(rèn)為恩度與接種同時進(jìn)行，有可能抑制了血管內(nèi)皮的爬行而遏制了腫瘤血管的快速增殖，而其他兩種情況就無此作用，顯然恩度對腫瘤的作用是有限的，這種限制與腫瘤接種生長有直接關(guān)系，而對預(yù)防性用藥和腫瘤已開始生長無關(guān)。

因此，恩度用藥時機(jī)有高度選擇性，作用于腫瘤生長的初期，其預(yù)防性用藥和腫瘤生長后用藥本研究未能看到確切的療效。本實驗研究恩度抗小鼠肝癌H22細(xì)胞株移植腫瘤的作用，選擇接種腫瘤前、接種腫瘤當(dāng)天、接種腫瘤之后3個給藥時間。希望通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)恩度抗腫瘤的最佳給藥時機(jī)。動態(tài)觀察恩度應(yīng)用后腫瘤生長情況，反映恩度與血管生成的相關(guān)性。結(jié)果表明在實驗第18天，接種腫瘤當(dāng)天開始給藥組（B組）與對照組（D組）相比腫瘤體積和微血管密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）與對照組（D組）腫瘤體積和微血管密度沒有統(tǒng)計學(xué)差異。說明腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，與之前的報道相符；用藥時機(jī)體現(xiàn)恩度抗腫瘤效果。本實驗提示接種腫瘤當(dāng)日開始給藥能體現(xiàn)恩度抗腫瘤作用；而接種腫瘤前和腫瘤開始生長后給藥不能體現(xiàn)恩度抗腫瘤效果。由此可見，恩度有可能只作用于新生血管，提前給藥對腫瘤血管著床以及已形成的腫瘤血管生長均無效，腫瘤生長后給藥對已形成的腫瘤血管生長也無效。腫瘤接種以后，接種和生長幾乎同時，有可能接種以后刺激機(jī)體產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子，刺激腫瘤固有血管增生，恩度正是對此產(chǎn)生作用。接種腫瘤后開始給藥無效是符合理論的，接種腫瘤前開始給藥無效與理論不符，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步研究恩度的抗腫瘤血管機(jī)制可對本實驗所留取腫瘤標(biāo)本，比較不同時間、不同組別小鼠腫瘤體積和微血管密度之間的差別。

綜上所述，接種腫瘤當(dāng)天開始腹腔注射恩度組（B組）小鼠腫瘤比單純造模組（D組）小鼠腫瘤小、腫瘤血管密度低，接種腫瘤前、后開始給藥組小鼠腫瘤體積與空白對照組小鼠腫瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異。接種腫瘤當(dāng)天開始腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。希望隨著恩度抗腫瘤機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，恩度成為癌癥治療的必不可少的重要藥物之一。

參考文獻(xiàn)

[1] 王金萬，孫燕，劉永煜，等.重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合NP方案治療晚期NSCLC隨機(jī)、雙盲、對照、多中心Ⅲ期臨床研究[J].中國肺癌雜志，2005，8（4）：283-290.

[2] Tan G H，Wei Y Q，Tian L，et al.Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen[J].Eur J Immunol，2004，34（7）：2012-2021.

[3] Tan G H，Tian L，Wei Y Q，et al.Combination of low-dose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a accine induces synergistic antitumor activities[J].Int J Cancer，2004，112（4）：701-706.

[4] Wozney J M.Overview of bone morphogenetic proteins[J].Spine，2002，27（16 Suppl 1）：S2-S8.

[5] 謝傳高，王興鵬.血管生成與胰腺癌[J].世界華人消化雜志，2001，9（3）：338-341.

（收稿日期：2012-09-05） （本文編輯：李靜）