口服避孕藥對高FSH 不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響

劉 錦 朱文杰周永紅 付志紅 李雪梅 唐雪蓮

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生殖科(518000)

基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)是臨床用于評估卵巢儲備功能的重要指標之一，基礎(chǔ)FSH升高提示卵巢的儲備功能下降，是40歲以后女性的生理表現(xiàn)。但臨床上常見有部分婦女在40歲之前就出現(xiàn)了FSH升高現(xiàn)象，表現(xiàn)為卵泡發(fā)育的速度異常，月經(jīng)周期縮短，周期第10天甚至更早就發(fā)生了排卵，導(dǎo)致臨床妊娠率下降，流產(chǎn)率增加［1］。目前治療高FSH的常用方法是用口服避孕藥反饋抑制垂體釋放FSH，達到治療的目的。研究表明口服避孕藥預(yù)處理可以增加高FSH患者體外受精-胚胎移植的成功率［2］，也有學(xué)者認為在使用口服避孕藥過程中進行垂體降調(diào)節(jié)(稱為“雙壓”方法)能抑制高FSH狀態(tài)，但其效果存在爭議。本研究通過觀察口服避孕藥治療前后子宮內(nèi)膜胞飲突、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、整合素β3等變化，探討口服避孕藥對高FSH患者子宮內(nèi)膜容受性的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2011年12月～2012年8月，在本院就診的不孕患者中，選擇連續(xù)兩個月經(jīng)周期第3天血清FSH水平＞10U/L的女性患者15例。病例納入標準:年齡＜40歲;月經(jīng)周期正常，研究前3個月內(nèi)無激素使用史及宮腔操作史，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。病例排除標準:多囊卵巢綜合征、排卵異常、宮腔粘連或瘢痕、宮腔積液、內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜異位癥或子宮肌腺癥，及既往有血栓病史者。病例年齡 33.07±4.62歲，不孕年限4.55±3.34年，基礎(chǔ)FSH水平18.53±5.96U/L，黃體生成素(LH)5.10±2.24U/L，雌二醇(E2)121.9±57.9pmol/L。體重指數(shù)(BMI)20.28±1.84kg/m2，月經(jīng)周期 26.82±1.15d。本組研究經(jīng)本院倫理委員會審查批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 排卵監(jiān)測和分組 月經(jīng)周期第8天開始，經(jīng)陰道超聲監(jiān)測卵泡生長，當優(yōu)勢卵泡直徑達14mm時，每天測卵泡大小及尿試紙法監(jiān)測LH峰預(yù)測排卵。排卵后7d取子宮內(nèi)膜標本(治療前)，下次周期月經(jīng)第5天開始口服避孕藥(媽富隆)1mg/d，連服21d，共3個周期。停藥后第1個月經(jīng)周期排卵后7天再次取子宮內(nèi)膜標本(治療后)。

1.2.2 標本采集及處理 ①采集方法:常規(guī)外陰陰道消毒，探宮腔，4～5號擴宮條擴張宮頸。將直徑0.3cm的內(nèi)膜取樣器(GYNETICS公司，比利時)輕輕送入宮腔至6.5cm，外抽內(nèi)芯約10cm長，負壓吸取少量內(nèi)膜組織。②標本處理:將吸取的內(nèi)膜組織放入4℃生理鹽水中快速洗去血污，并用干紗塊吸去水分，一部分放入4%甲醛固定液中，用于病理檢查及免疫組化測定子宮內(nèi)膜容受性生化標記因子;另一部分放入2.5%戊二醛固定液中，用于掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況。

1.2.3 病理檢查 子宮內(nèi)膜標本按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片并經(jīng) HE染色后，按病理學(xué)子宮內(nèi)膜分期標準進行病理分期。

1.2.4 生化標記因子測定 免疫組化按照試劑盒步驟操作，一抗LIF、VEGF 及MMP9(BA1239、BA0407和BA0573，武漢博士德生物工程公司)按1∶50稀釋，4℃冰箱過夜;滴加聚合 HRP-羊抗兔 IgG(SV0002，武漢博士德生物工程公司)，37℃ 30min。標志物整合素β3熱修復(fù)抗原后再用3%H2O2去離子水孵育10min，一抗整合素 β3(sc-6626，santa cruz biotechnology，美國)按1∶100稀釋，4℃冰箱過夜，滴加試劑1(PV-9003，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫20min，滴加試劑2(PV-9003，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫20min。DAB(Tnvitrogen公司，美國)顯色結(jié)果判定標準:陰性對照片用PBS代替一抗判讀。顯微鏡(400×)下觀察，選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個腺體細胞，分別讀出其中陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)和強陽性(+++)的細胞數(shù)。用組織學(xué)積分H-score方法進行半定量分析，計算公式:H-score=ΣPi(i+1)，其中Pi代表每一免疫組化染色范圍內(nèi)同一染色強度的陽性細胞數(shù)占待測細胞總數(shù)的百分比，即Pi=陽性細胞數(shù)/待測細胞總數(shù)。i為染色強度，用1、2、3分別代表(+)、(++)、(+++)，i=0時，染色陰性，組織學(xué)積分為0。

1.2.5 內(nèi)膜表面胞飲突的數(shù)量及形態(tài)觀察 內(nèi)膜標本經(jīng)梯度乙醇脫水、干燥和金屬鍍膜處理后，掃描電鏡下每張片觀察3個視野。計算內(nèi)膜表面胞飲突的覆蓋面積:豐富(＞50%)，中等(20% ～50%)，少量(＜20%)。胞飲突的形態(tài)分為發(fā)育期、完全發(fā)育期、退縮期。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后內(nèi)分泌激素及卵泡期的變化

口服避孕藥治療前后基礎(chǔ) FSH、LH、E2、孕酮(P)、睪酮(T)水平，黃體中期E2、P水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。治療后卵泡期天數(shù)長于治療前(P＜0.01)，見表1。

2.2 治療前后子宮內(nèi)膜病理變化

治療前15例標本顯示分泌中期內(nèi)膜9例，其余6例為增生期內(nèi)膜(4例為增生反應(yīng)內(nèi)膜，2例呈增生-分泌反應(yīng)內(nèi)膜)黃體中期內(nèi)膜變化與月經(jīng)周期有9例(9/15)達到同步;治療后15個標本均為分泌中期反應(yīng)子宮內(nèi)膜，內(nèi)膜發(fā)育與月經(jīng)周期均達到同步，治療前后內(nèi)膜與月經(jīng)周期變化的同步性有差異(P＜0.01)。

2.3 掃描電鏡觀察

治療后胞飲突數(shù)量豐富，多為發(fā)育完全的胞飲突;治療前胞飲突數(shù)量稍欠豐富，多處在發(fā)育中期和退縮期，治療前后胞飲突形態(tài)有差異(P＜0.05)，但豐富程度無差異(P＞0.05)。見表2，圖1。

表115 例治療前后內(nèi)分泌激素水平及卵泡期天數(shù)比較()

表115 例治療前后內(nèi)分泌激素水平及卵泡期天數(shù)比較()

＊治療前后比較P＜0.01

項目 治療后 治療前P 17.72±7.41 18.53±5.96 0.770基礎(chǔ)LH(U/L) 4.70±2.50 5.10±2.24 0.627基礎(chǔ)E2(pmol/L) 141.7±105.90 122.25±58.10 0.603基礎(chǔ)P(nmol/L) 1.18±1.02 1.53±0.67 0.352基礎(chǔ)T(nmol/L) 1.21±1.04 1.11±2.26 0.647黃體期E2(pmol/L) 548.67±246.39 776.83±482.75 0.135黃體期P(nmol/L) 40.96±21.53 46.52±24.90 0.468卵泡期天數(shù) 15.53±4.05 13.26±1.23 0.009基礎(chǔ)FSH(U/L)*

表2 治療前后子宮內(nèi)膜胞飲突數(shù)量和發(fā)育情況比較［個(%)］

圖1 不同發(fā)育階段的胞飲突形態(tài)

2.4 內(nèi)膜腺體LIF、VEGF、MMP9和整合素β3表達情況

治療前后子宮內(nèi)膜腺體LIF、整合素β3表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而內(nèi)膜腺體VEGF、MMP9表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2，表3)。

圖2 子宮內(nèi)膜LIF、整合素β3、MMP9和VFGF的表達

表3 治療前后內(nèi)膜腺體激素表達量比較(s)

表3 治療前后內(nèi)膜腺體激素表達量比較(s)

*治療前后比較P＜0.05

項目 治療后 治療前P LIF 2.41±0.50 1.91±0.46 0.031*整合素β3 2.39±0.41 2.10±0.26 0.033*MMP9 3.04±0.96 2.88±0.97 0.756 VEGF 2.47±0.52 2.20±0.37 0.142

3 討論

本組研究發(fā)現(xiàn)高FSH不孕患者常發(fā)生卵泡期縮短，甚至在月經(jīng)周期第10天即發(fā)生排卵。黃體中期子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化與月經(jīng)周期不同步，有40%的黃體中期子宮內(nèi)膜仍處于增生期，這將導(dǎo)致內(nèi)膜容受性低下，胚胎種植困難。筆者認為，這可能是高FSH患者臨床妊娠率低下，流產(chǎn)率升高的原因之一。

正常狀態(tài)的子宮內(nèi)膜僅在一個極短的關(guān)鍵時期內(nèi)，即排卵后6～7d天(又稱種植窗期)具有容受胚胎的能力。整合素、LIF、VEGF以及MMP9是眾多研究公認的種植窗期子宮內(nèi)膜容受性標記因子［3～10］，而胞飲突則是形態(tài)學(xué)上的子宮內(nèi)膜容受性標記物［11，12］，本組研究選用上述意義明確的內(nèi)膜容受性標記物，增加了研究結(jié)果的可信度。

口服避孕藥是一種包含有雌孕激素的類固醇激素，能夠通過負反饋抑制垂體FSH、LH的分泌，是臨床治療高FSH患者的常用藥物。但是口服避孕藥能否改善卵巢儲備功能低下的不孕患者的內(nèi)膜容受性尚未見文獻報道。本組研究通過掃描電鏡觀察內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育狀態(tài)，用免疫組化方法測定內(nèi)膜容受性標記因子LIF、VEGF、MMP9、整合素β3的表達情況，結(jié)果表明口服避孕藥治療后子宮內(nèi)膜生長轉(zhuǎn)化與月經(jīng)周期的同步性明顯改善，短卵泡期狀態(tài)得到了糾正，黃體中期(種植窗口期)完全發(fā)育胞飲突率增加，LIF、整合素β3的表達量增加，提示口服避孕藥提高了高FSH患者的子宮內(nèi)膜容受性。

早在1989年 Check等［13］就曾報道過1例35歲卵巢早衰，血FSH升高的女性不孕患者經(jīng)過避孕藥物治療后成功受孕。甄秀梅等［14］在短方案體外受精-胚胎移植周期前用避孕藥預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)使用避孕藥后基礎(chǔ)FSH明顯下降。本組資料表明，避孕藥治療后，基礎(chǔ)FSH并無明顯下降，這可能是由于本組研究使用避孕藥的時間較長，卵巢儲備功能低下隨時間延長而加劇，基礎(chǔ)FSH水平上升，掩蓋了避孕藥中雌孕激素成分反饋抑制FSH的作用。另外，血FSH水平還受早卵泡期小卵泡分泌的抑制素影響［15］，口服避孕藥不能改變卵巢的儲備功能，因此不能改變小卵泡數(shù)和血FSH的上升。然而口服避孕藥改善了內(nèi)膜發(fā)育與月經(jīng)周期的同步性，使得內(nèi)膜容受性因子LIF、整合素β3表達增加，完全發(fā)育胞飲突比率增加，可能與其作用于下丘腦-垂體-卵巢軸，在一定程度上調(diào)整了月經(jīng)周期，減少了卵泡過早發(fā)育有關(guān)。治療后黃體中期血清E2和P水平下降，雖然沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但從另一側(cè)面反映了口服避孕藥治療后卵泡發(fā)育或卵子質(zhì)量變化的復(fù)雜性。另外，本組數(shù)據(jù)僅反應(yīng)了3個月口服避孕藥治療后的第1個自然周期的狀態(tài)，這種療效能持續(xù)多久，尚有待進一步的觀察和研究。

綜上所述，高FSH不孕患者經(jīng)口服避孕藥治療3個周期可調(diào)整月經(jīng)周期，改善內(nèi)膜發(fā)育與月經(jīng)周期的同步性，提高子宮內(nèi)膜容受性，有利于胚胎著床。

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