宮頸病變程度與人乳頭瘤病毒16型甲基化水平的關(guān)系研究

王海英

浙江省嘉興市秀州區(qū)計(jì)劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站、婦幼保健院(314031)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，而人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要致癌因子［1］。1995年世界衛(wèi)生組織將HPV確定為宮頸癌的病因［2］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種亞型中近40種能入侵生殖器官，其中 16、18、31、33、35 及58型等高危亞型的感染是女性宮頸癌的主要病因，尤其是16型，在所有宮頸癌中占比50%左右［3］。然而，并非所有的HPV感染都將導(dǎo)致宮頸癌，宮頸癌的形成一般需要經(jīng)歷HPV持續(xù)感染、癌前病變到癌癥的過程［4］。因此，在感染HPV到宮頸癌發(fā)生之間進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)和治療將會(huì)有效阻斷病變的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，減少癌癥的形成，提高治愈率。傳統(tǒng)的巴氏涂片、新柏氏液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)(TCT)組織學(xué)檢查、免疫組化技術(shù)等均存在診斷敏感性較差的問題［5，6］。越來越多的研究表明 HPV DNA 檢測是一種經(jīng)濟(jì)、創(chuàng)傷性小并且敏感度高的篩查手段，但HPV感染的患者即使感染高危型其潛在的宮頸病變可能仍然較小［7］。因此，在HPV篩查的基礎(chǔ)上還需有更好的分子標(biāo)記來進(jìn)一步評(píng)估患者在HPV感染后潛在的病變風(fēng)險(xiǎn)，以便臨床醫(yī)生能據(jù)此制定治療方案。研究表明，HPV基因組表觀遺傳學(xué)如甲基化等的改變與宮頸病變存在一定的相關(guān)性，特別是L1基因的甲基化水平，在不同宮頸病變中存在差異［8］。本文選擇感染比例最高的HPV16型，通過分析不同病變階段的HPV16感染患者中HPV基因組L1基因開放閱讀框以及上游調(diào)控區(qū)(URR)的甲基化水平，來評(píng)估HPV16型L1的區(qū)域甲基化水平與宮頸病變的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)除現(xiàn)有的HPV分型體系外更有效的評(píng)估HPV感染后潛在病變風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集本院2012年2～8月進(jìn)行宮頸病變篩查婦女的宮頸分泌物標(biāo)本518例，所有患者均有性生活史，取材前3天內(nèi)無陰道沖洗及無陰道用藥史。

1.2 試劑與儀器

人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒、分子雜交儀(深圳亞能生物技術(shù)有限公司，中國);血清游離DNA提取試劑盒(北京金麥格生物技術(shù)有限公司，中國);PCR儀(Bio-Rad，美國);Taq酶等PCR擴(kuò)增體系試劑盒(Fermentas，加拿大);DNA甲基化試劑盒 (Methylation-Gold KitTM，ZYMO公司，美國)。DNA聚合酶等PCR擴(kuò)增體系試劑均購自美國Promega公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CIN檢查及HPV陽性病例篩查 對(duì)518例標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，按Richart標(biāo)準(zhǔn)將宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)分為 CIN1、CIN2、CIN3三級(jí)，分別指輕、中、重度宮頸鱗狀上皮非典型增生。病理醫(yī)生行盲法閱片進(jìn)行診斷，所有異常切片均由兩位病理醫(yī)生按Richart標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核。HPV檢測及分型從HPV DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交檢測到結(jié)果判讀均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 HPV16 DNA甲基化 使用血清游離DNA提取試劑盒，對(duì)篩選出的HPV16型陽性病例血清基因組DNA進(jìn)行提取純化。DNA的甲基化鑒定按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。在PCR管中添加130μl CT轉(zhuǎn)化劑，加入20μl DNA樣品，用移液器吹打混勻;PCR 條件為 98℃ 10min，64℃ 2.5h，4℃ 保存24h;反應(yīng)完成后，添加600μl結(jié)合緩沖液到試劑盒的預(yù)裝柱中，并將柱放入收集管中，加入反應(yīng)液，蓋上后將柱顛倒數(shù)次混合樣品;10 000rpm/min離心30s，去除流出液;再按照試劑盒要求離心洗脫DNA。

1.3.3 HPV16型DNA PCR擴(kuò)增及測序 HPV16型L1基因區(qū)域甲基化位點(diǎn)及其相應(yīng)的PCR引物序列、退火溫度、片段長度等見表1所示。PCR擴(kuò)增體系為:5×Green GoTaq反應(yīng)緩沖液 10μl，正向引物1μl，反向引物 1μl，DNA 5μl，dNTPs 0.4mmol/L，MgCl22mmol/L，DNA聚合酶2U，加無菌水至50μl;PCR擴(kuò)增條件為:94℃ 3min;40個(gè)循環(huán)(94℃ 30s，退火30s，72℃ 30s);72℃ 3min(各片段引物退火溫度見表1)。所有引物均由上海英濰捷基生物科技有限公司合成，反向引物均用生物素標(biāo)記。所擴(kuò)增的產(chǎn)物送基因工程上海有限公司進(jìn)行焦磷酸測序及數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0錄入相關(guān)數(shù)據(jù)后對(duì)不同宮頸病變程度的各位點(diǎn)甲基化水平分別進(jìn)行兩兩χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)檢查與HPV 分型檢測

按Richart標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)共獲得CIN1標(biāo)本46例，CIN2標(biāo)本32例，CIN3標(biāo)本18例以及宮頸癌標(biāo)本9例，其余均無宮頸病變，檢測陽性率20.3%。采用亞能HPV雜交分型試劑盒對(duì)518例樣本進(jìn)行基因分型，共獲得陽性標(biāo)本198例，陽性率38.2%，其中HPV16型單型陽性標(biāo)本73例，占陽性標(biāo)本數(shù)的36.9%。73例HPV16單型陽性標(biāo)本中，無宮頸病變的37例，CIN1標(biāo)本17例，CIN2標(biāo)本9例，CIN3 標(biāo)本7例以及宮頸癌標(biāo)本4例。

表1 HPV16各甲基化位點(diǎn)所需PCR引物序列

2.2 宮頸病變各階段HPV16陽性標(biāo)本甲基化分析

不同宮頸病變階段HPV16陽性標(biāo)本各位點(diǎn)甲基化水平如表2所示。其中31，37，43，52，58位點(diǎn)在不同宮頸病變階段的標(biāo)本中呈現(xiàn)出一致性，即正常標(biāo)本存在中度甲基化，CIN1～CIN3標(biāo)本存在低度甲基化，而宮頸癌(CA)標(biāo)本表現(xiàn)為高度甲基化;正常標(biāo)本與CIN標(biāo)本各位點(diǎn)甲基化水平兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常標(biāo)本與CA標(biāo)本各位點(diǎn)甲基化水平相比存在顯著差異(P＜0.05)，同時(shí)，CIN標(biāo)本與CA標(biāo)本各位點(diǎn)甲基化水平相比較也存在顯著差異(P＜0.05)，;而在CIN1，CIN2以及CIN3間甲基化水平無顯著差異。3887、3927、3941以及5602位點(diǎn)甲基化水平隨著宮頸病變程度的加深而升高，并且正常標(biāo)本，CIN1、CIN2、CIN3、CA間兩兩比較均存在顯著差異(P均 ＜0.05);5608、5709、5611、5617、5762、6367、6389 位點(diǎn)甲基化水平在正常標(biāo)本和CIN1、CIN2和CIN3標(biāo)本間無顯著差異，但正常標(biāo)本與CA標(biāo)本以及CIN標(biāo)本與CA標(biāo)本間比較，甲基化水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 不同宮頸病變階段HPV16陽性標(biāo)本各位點(diǎn)甲基化水平(%)

3 討論

高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要因素，但同樣的HPV型感染后臨床表現(xiàn)卻大不相同。因此除了對(duì)HPV DNA進(jìn)行基因差異及分型研究外，需要尋找其他導(dǎo)致這種差異的因素?；蚣谆碛^遺傳學(xué)改變是指針對(duì)DNA的修飾而非基因序列改變所導(dǎo)致的基因表達(dá)水平的變化［9］。近年來，眾多研究證據(jù)表明，表觀遺傳學(xué)的改變可能是影響病毒毒性以及導(dǎo)致致病性差異的又一潛在因素［10～12］。為了研究HPV基因組甲基化水平與感染后宮頸病變程度的關(guān)系，本研究采用重硫酸鹽-焦磷酸測序法對(duì)HPV16陽性的73例標(biāo)本，包括無宮頸病變的37例、CIN1標(biāo)本17例、CIN2標(biāo)本9例、CIN3標(biāo)本7例以及宮頸癌標(biāo)本4例進(jìn)行了L1基因ORF以及URR區(qū)域的CpG位點(diǎn)的甲基化水平定量分析。焦磷酸測序可對(duì)特定位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行定量分析，目前已廣泛應(yīng)用于基因甲基化的檢測，經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，無甲基化的C堿基被轉(zhuǎn)化成T堿基，而甲基化修飾的則不變，因此通過測定C/T的單核苷酸多態(tài)性即可反映基因的甲基化水平。初步結(jié)果表明，各位點(diǎn)的甲基化水平與宮頸病變程度存在一定的相關(guān)性，但不同位點(diǎn)其表現(xiàn)形式存在一定的區(qū)別。據(jù)本研究的結(jié)果可將HPV16型DNA特定位點(diǎn)甲基化水平與宮頸病變程度的關(guān)系歸納為3種模式:模式 1 的位點(diǎn)包括 31、37、43、52、58，通過對(duì)這些位點(diǎn)的甲基化進(jìn)行定量分析，可將疑似宮頸病變患者進(jìn)行正常、CIN和CA的診斷，但不能對(duì)CIN各期進(jìn)行具體劃定;模式2的位點(diǎn)包括3887、3927、3941以及5602，由于這些位點(diǎn)在不同宮頸病變階段其甲基化水平均存在顯著差異，因此可作為宮頸病變分期的指標(biāo)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行正常、CIN1、CIN2、CIN3、CA之間的區(qū)分診斷;模式3的位點(diǎn)包括5608、5709、5611、5617、5762、6367、6389，根據(jù)這些位點(diǎn)的甲基化水平只能診斷是否為CA標(biāo)本，而無法對(duì)癌前病變進(jìn)行具體分級(jí)。

本文結(jié)果表明HPV16型L1基因區(qū)域特定位點(diǎn)的甲基化水平與宮頸病變程度間存在一定的相關(guān)性，HPV16型L1基因區(qū)域相關(guān)位點(diǎn)的甲基化定量分析可作為進(jìn)行宮頸病變分級(jí)的一個(gè)潛在指標(biāo)，與組織病理學(xué)診斷相比，該指標(biāo)更顯客觀。但若在臨床上推廣應(yīng)用則需要進(jìn)行更多實(shí)驗(yàn)。本文主要對(duì)在HPV中占多數(shù)的16型進(jìn)行了研究，而對(duì)于其他型別是否適用本文結(jié)論則需作進(jìn)一步深入的研究。

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