米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷的影響*

吳春平，王國紅，張 勇，李東亮

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003）

孕酮（progesterone，PROG）是性腺分泌的甾體激素，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它也可在神經(jīng)系統(tǒng)生成并影響神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能，被稱為神經(jīng)活性甾體（neuroactive steroid）。本實(shí)驗(yàn)室先前已經(jīng)證明PROG可減輕大鼠腦缺血／再灌注損傷（ischemia／reperfusion injury，IRI）引起的腦水腫，降低血腦屏障通透性，促進(jìn)腦IRI大鼠的行為恢復(fù)［1］。最近本室在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞證明孕酮可減輕氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）對(duì)神經(jīng)元的損傷。然而孕酮的防護(hù)作用是通過核受體介導(dǎo)的基因途徑，還是通過膜受體介導(dǎo)的非基因途徑目前尚不清楚［2］。本文在PC12細(xì)胞的OGD損傷模型，觀察孕酮核受體拮抗劑米非司酮（mifepristone，MIF）阻斷孕酮核受體前后細(xì)胞形態(tài)、存活率、培養(yǎng)液中葡萄糖含量的變化，探討核受體介導(dǎo)的基因途徑在孕酮抗OGD損傷中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）購自美國 Invintrogen公司；DMEM培養(yǎng)基（無糖、無酚紅）、孕酮、米非司酮和2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-［（phenylamino）carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide（XTT）購于美國 Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒購于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

PC12細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U／ml芐青霉素和100 U／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分5組，正常對(duì)照組（normal）：常氧常糖培養(yǎng)；OGD模型組（model）：接種24 h后行OGD處理30min，后復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24 h；PROG組：OGD和復(fù)氧復(fù)糖期間培養(yǎng)基中含10 nmol／L孕酮，余同 model組；PROG＋MIF組：10μmol／L MIF預(yù)處理 30 min后，按PROG組操作進(jìn)行；MIF組：不行PROG處理，余同PROG＋MIF組。各組按上述處理后進(jìn)行各指標(biāo)檢測。

1.3 PC12細(xì)胞OGD模型制備

參照文獻(xiàn)［3］對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪處理。細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無糖無酚紅DMEM培養(yǎng)基后，放入低氧艙中，快速充入含95%N2、5%CO2混合氣體，低氧艙氧濃度低于1%開始計(jì)時(shí)，持續(xù)低氧30 min，低氧過程中環(huán)境溫度維持在37℃。

1.4 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞以5×104cells／ml的密度接種于24孔板中，接種24 h后隨機(jī)分組并按上述操作行各組處理，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，然后行HE染色。

1.5 XTT法檢測細(xì)胞活力

細(xì)胞以5×104cells／ml的密度接種于96孔板，24 h后隨機(jī)分組，每組設(shè)5復(fù)孔，各組行上述處理。XTT檢測時(shí)，每孔加入預(yù)溫37℃50μl的XTT工作液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。然后用ELX-800（Bio-Tek）酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值，測定波長450 nm，參考波長650 nm。計(jì)算各組細(xì)胞活力（Viability）。計(jì)算公式如下：細(xì)胞活力＝（實(shí)驗(yàn)組吸光度－空白組吸光度）／（對(duì)照組吸光度－空白組吸光度）×100%

1.6 臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞

各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化30 s，完全培養(yǎng)基終止消化，吹打成的單細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液1∶1混勻，臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)每毫升細(xì)胞懸液中活細(xì)胞數(shù)（viable count）。

1.7 葡萄糖含量的測定

每孔取10μl培養(yǎng)液，用氧化酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量，嚴(yán)格按試劑盒操作流程進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算方法：葡萄糖（mmol／L）＝樣本吸光度（A）／校準(zhǔn)吸光度（A）×校準(zhǔn)液濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析，兩兩比較均采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)氧糖剝奪PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置鏡下normal組PC12細(xì)胞多呈梭型或三角形，折光性強(qiáng)，兩極伸出較長突起，部分突起可發(fā)出分枝并交織成網(wǎng)狀；HE染色顯示，與normal組相比model組細(xì)胞皺縮變圓，折光性下降，突起減少或消失，部分細(xì)胞裂解成碎片，細(xì)胞密度明顯降低，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮呈黑色，細(xì)胞邊集，中央細(xì)胞稀疏。PROG組細(xì)胞大部分仍呈梭形，胞體皺縮減輕，仍有細(xì)短突起，細(xì)胞密度較model組增加。PROG＋MIF組和MIF組的細(xì)胞形態(tài)和密度與model組相似，表明MIF可阻斷孕酮改善OGD細(xì)胞形態(tài)損傷的作用。

2.2 米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)氧糖剝奪PC12細(xì)胞活力的影響

XTT法檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示，model組細(xì)胞活力明顯低于 normal組（P＜0.01），PROG組則顯著高于 model組（P＜0.01），PROG＋MIF組和MIF組的細(xì)胞活力明顯低于PROG組（P＜0.05），而與 model組無顯著性差異（P＞0.05）。孕酮可顯著提高OGD后PC12細(xì)胞活力，具有較好的防護(hù)作用，而米非司酮阻斷了孕酮91.8%±3.2%的防護(hù)作用 （表1）。

2.3 米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)氧糖剝奪PC12活細(xì)胞數(shù)的影響

Model組的活細(xì)胞數(shù)明顯低于 normal組（P＜0.05）。PROG組的活細(xì)胞數(shù)較model組顯著增多（P＜0.05）。PROG＋MIF組的活細(xì)胞數(shù)與model組無明顯差異（P＞0.05），顯著低于孕酮組 （P＜0.05），米非司酮拮抗了孕酮 85.0%±2.6%的作用。MIF組與model組、PROG＋MIF組之間均無顯著差異（P＞0.05，表 1）。

2.4 孕酮和米非司酮對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量的影響

Model組細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量顯著高于normal組（P＜0.05）。PROG組明顯低于 model組 （P＜0.05）。PROG＋MIF組和MIF組明顯高于PROG組 （P＜0.05），與model組相比無明顯差異（P＞0.05，表 1）。

Tab.1 Effects of progesterone and mifepristone on cell viability，viable count and glucose content in themedium

3 討論

傳統(tǒng)認(rèn)為孕酮可通過位于細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)的受體，刺激基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，產(chǎn)生基因效應(yīng)。近年來的研究表明孕酮也可通過膜受體將細(xì)胞外信號(hào)傳遞給胞內(nèi)第二信使，發(fā)揮非基因效應(yīng)。目前雖然在很多物種克隆出孕酮膜受體的cDNA和重組蛋白，然而膜受體的本質(zhì)到現(xiàn)在還不完全明確。我們前期工作表明孕酮可以增加氧糖剝奪PC12細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT3的表達(dá)，減少PC12細(xì)胞的死亡［4］。但它是通過基因效應(yīng)，還是通過非基因效應(yīng)目前并不明了，國內(nèi)外也少有報(bào)道。人工合成的米非司酮（RU486）是孕酮的特異性核受體阻斷劑，對(duì)孕酮核受體有很高的親和力，拮抗孕酮的作用很強(qiáng)，常被用于研究甾體激素受體作用機(jī)制的工具藥［5］。本實(shí)驗(yàn)證明PROG組細(xì)胞活力顯著高出OGD模型組（P＜0.01），而預(yù)先用孕酮的核受體阻斷劑米非司酮處理則可顯著拮抗孕酮的作用，細(xì)胞活力下降到model組水平（P＞0.05），米非司酮對(duì)孕酮的阻斷作用達(dá) 91.8%±3.2%。臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞結(jié)果與XTT檢測結(jié)果一致，米非司酮可阻斷孕酮85.0%±2.6%的作用。用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，可間接反映細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗情況。結(jié)果表明model組培養(yǎng)基中的葡萄糖含量顯著增高，PROG組則顯著降低，PROG＋MIF組明顯升高，表明孕酮減少細(xì)胞死亡，增加了葡萄糖的消耗，而這種防護(hù)作用被米非司酮所拮抗。上述結(jié)果表明孕酮對(duì)OGD損傷PC12細(xì)胞的防護(hù)作用可能主要是通過核受體介導(dǎo)的基因效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

［1］ 李東亮，趙紅崗，王東霞，等.孕酮對(duì)腦缺血再灌注大鼠紋狀體水、鈉、鉀及鈣含量的影響［J］.中國病理生理雜志，2001，17（10）：1012-1015.

［2］ Kilic F，Kashikar N D，Schmidt R，et al.Caged progesterone：a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone［J］.J Am Chem Soc，2009，131（11）：4027-4030.

［3］ Li H，Hu J，Ma L，et al.Comprehensive study of baicalin down-regulating NOD2 receptor expression of neurons with oxygen-glucose deprivationin vitroand cerebral ischemiareperfusionin vivo［J］.Eur JPharmacol，2010，649（1-3）：92-99.

［4］ 侯志慧，王國紅，吳春平，等.孕酮對(duì)氧糖剝奪損傷的PC12細(xì)胞的防護(hù)作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28（2）：269-273.

［5］ Butts C L，Shukair SA，Duncan K M，et al.Progesterone inhibitsmature rat dendritic cells in a receptor-mediated fashion［J］.Int Immunol，2007，19（3）：287-296.