降鈣素基因相關肽對低氧性肺動脈高壓肺動脈膠原沉積的影響*

李先偉，杜 潔，李元建△

（1.皖南醫(yī)學院藥理學教研室，安徽 蕪湖241002；2.中南大學藥學院藥理學系，湖南 長沙410078）

肺動脈高壓是眾多心肺血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理生理環(huán)節(jié)，血管重構是肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）的重要病理特征，肺小血管肌化可引起肺血管阻力增加，最終導致失代償性心衰甚至死亡［1］。膠原作為細胞外基質(zhì)的重要組成部分，在肺血管結構重建過程中發(fā)揮了極其重要的作用［2］。大量研究表明，降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）在 PAH血管重構中起著重要的作用［3，4］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，CGRP能夠抑制低氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞（PASMCs）的增殖，其機制與其抑制細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 1／2（ERK1／2）信號通路有關［5］，但其對細胞外基質(zhì)重構是否有作用尚不清楚。本研究首先通過低氧性PAH動物模型，研究內(nèi)源性CGRP對低氧性PAH肺血管膠原代謝的影響。然后在培養(yǎng)的PASMCs中，觀察外源性CGRP是否可以抑制低氧誘導的細胞膠原的表達，進而探討CGRP對PAH血管重構的作用及其可能機制，希望能為低氧性PAH發(fā)病機制提供新的實驗證據(jù)，并為尋找治療低氧性PAH藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，體重180～220 g（湖南斯萊克）。小鼠抗大鼠 ERK1／2及 phospho-ERK1／2（p-ERK1／2）單克隆抗體（美國 cell signaling）。Masson染色試劑盒（南京凱基）。CGRP放射免疫試劑盒（北京東亞）。BrdU增殖檢測試劑盒（美國 Roche）；CGRP、CGRP8-37及 ERK1／2抑制劑 PD 98059（美國 sigma）；PrimeScriptTM RT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix（大連寶生物工程有限公司），引物設計合成（上海生物）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型的制備 大鼠適應性喂養(yǎng)一周，按體重隨機分為 3組：（1）常氧組（Normoxia）；（2）低氧組（Hypoxia）；（3）Hypoxia＋辣椒素（Capsaicin）組：低氧前4 d大鼠皮下注射辣椒素（50 mg／（kg·d）），耗竭內(nèi)源性 CGRP。Hypoxia與 Hypoxia＋Capsaicin組放入含10%氧氣的低氧倉中，倉中用無水氯化鈣吸收水分，鈉石灰吸收二氧化碳。維持3周即可成模。

1.2.2 血流動力學指標的測定 造模后3周用2%戊巴比妥鈉（60mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠。將連有壓力換能器的聚乙烯導管經(jīng)右頸外靜脈插入右心室及肺動脈，分別記錄右心室收縮壓（RVSP）和平均肺動脈壓（mPAP）。

1.2.3 肺組織血管形態(tài)學觀察及Masson染色 取大鼠左肺以4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，行HE染色。每只大鼠選1張肺結構完整的切片，利用Nikon＆spot圖像采集處理系統(tǒng)，每張切片隨機計算20根管徑50～100μm的肺小動脈管壁厚度（血管內(nèi)膜和外膜之間距離）和外徑，將肺小動脈管壁厚度占外徑的百分比WT%（WT%＝管壁厚度／外徑×100%）作為肺血管重構的量化指標。肺組織Masson膠原染色按試劑盒說明書進行。

1.2.4 血漿CGRP濃度測定 頸動脈采血2 ml集中于含10%Na2EDTA 40μl和抑肽酶40μl的試管中，3 500 r／min，4℃離心 20 min，收集血漿，按 CGRP放免試劑盒說明書測定血漿中CGRP的濃度。

1.2.5 大鼠原代肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的培養(yǎng)及細胞實驗分組 按文獻采用組織貼塊法制備PASMCs［6］，經(jīng) alpha-smooth muscle actin（α-SMA）免疫熒光染色鑒定后3～8代用于實驗。細胞實驗分8組，每組9個樣本：（1）Normoxia組：細胞用 21%O2處理 48 h；（2）Hypoxia組：細胞用 3%O2處理 48 h；（3）Hypoxia＋二甲基亞砜（DMSO）組：細胞用PD98059溶媒DMSO預處理1 h，再低氧處理48 h；（4）Hypoxia＋PD98059 1μmol／L組：細胞用 PD98059 1μmol／L預處理 1 h，再低氧處理 48 h；（5）Hypoxia＋CGRP 1 nmol／L組：細胞用 CGRP（1 nmol／L）預處理 1 h，再低氧處理 48 h；（6）Hypoxia＋CGRP 10 nmol／L組：細胞用 CGRP（10 nmol／L）預處理1 h，再低氧處理48 h；（7）Hypoxia＋CGRP 100 nmol／L組：細胞用CGRP（100 nmol／L）預處理 1 h，再低氧處理 48 h；（8）Hypoxia＋CGRP8-371μmol／L和 CGRP 100 nmol／L組：細胞用 CGRP8-37（1μmol／L）和 CGRP（100 nmol／L）預處理1 h，再低氧處理48 h。

1.2.6 BrdU法測定細胞增殖 細胞以6×103cells／well的密度種于96孔板，貼壁后用1%FBS的DMEM高糖培基處理24 h。細胞分別根據(jù)細胞實驗設計進行處理，處理結束時，每孔加入10μl BrdU，正常培養(yǎng)條件下孵育4 h，固定液室溫孵育30 min，室溫孵育BrdU抗體90min，PBS洗滌5min×3，加入200μl底物室溫反應 15 min，每孔加入 1 mol／L硫酸 25μl，2 min之內(nèi)在450 nm波長下用酶標儀檢測光密度值（OD值）。每組9個復孔。

1.2.7 Real Time PCR檢測 CGRP、collagenⅠ和 collagenⅢmRNA的表達 用Trizol等試劑提取組織或細胞總RNA后，按逆轉錄試劑盒操作步驟進行RT反應。所得cDNA在實時熒光定量PCR儀（7300 Real Time PCR System，Applied Biosystem）上進行反應。按照說明，使用Power SYBR Green PCRMaster Mix試劑盒，以2μl cDNA為模板，以 GAPDH為內(nèi)參照，PCR擴增基因片段（表1）。PCR反應參數(shù)：預變性95℃ 30 s，95℃變性 5 s，60℃退火和延伸 31 s，共 40個循環(huán)，在延伸的過程中搜集熒光信號。于每次擴增的同時設置無cDNA的陰性對照，將PCR產(chǎn)物做熔解曲線，以證實以上 PCR反應產(chǎn)物特異性良好。用7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計ΔΔCt值，計算RQ值以比較各組mRNA的表達。

Tab.1 Primer sequences used for determination of CGRP、collagenⅠand collagenⅢgene expression

1.2.8 Western blot檢測 ERK1／2及 p-ERK1／2蛋白表達 低溫提取組織或細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣50μg蛋白，12%SDS-PAGE分離樣品，轉膜，封閉，一抗（1∶1 000）4℃過夜。洗膜，二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的 LunimataTM Crescendo發(fā)光劑加到膜的正面，采用 Bio-Rad ChemiDoc XRS＋成像系統(tǒng)進行拍照用，Image J 1.43（National Institutes of Health）軟件進行灰度值分析并比較各組蛋白表達差異。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差（±s），統(tǒng)計分析采用 SPSS l3.0軟件。多組均數(shù)比較采用ANOVA及Newman-Keuls-Student多重比較t檢驗分析。

2 結果

2.1 Capsaicin對低氧誘導的 PAH大鼠 RVSP、mPAP及血管重構的影響

經(jīng)過3周持續(xù)低氧，Hypoxia組 RVSP、mPAP均顯著高于Normoxia組（P＜0.01）；HE染色顯示Hypoxia組肺小血管顯著增厚，WT%明顯升高。而用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠加重低氧誘導的上述改變（P＜0.05，圖 1，表 2）。

Tab.2 Effectof capsaicin on RVSP，mPAPandWT%in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（±s，n＝8）

Tab.2 Effectof capsaicin on RVSP，mPAPandWT%in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（±s，n＝8）

RVSP：Right ventricle systolic pressure；mPAP：Mean pulmonary arterial pressure；WT%：Wall thickness／external diameter×100%**P＜0.01 vs Normoxia；＃P＜0.05 vs Hypoxia

Group RVSP（mmHg） mPAP（mmHg） WT（%）Normoxia 26.83±2.68 19.09±2.01 36.28±6.09 Hypoxia 37.03±4.18**25.21±1.88**52.19±7.59**Hypoxia＋capsaicin 42.51±3.81＃ 28.49±2.24＃ 63.16±9.79＃

Fig.1 Effect of capsaicin on pulmonary vascular remodeling in hypoxia-induced pulmonary arterialhypertension of rats（HE×200）

2.2 Capsaicin對低氧誘導的PAH大鼠肺動脈膠原表達的影響

Masson染色結果顯示Normoxia組僅少數(shù)肺動脈外膜出現(xiàn)藍染的膠原纖維，小動脈中膜和內(nèi)膜層未見藍染的膠原纖維；Hypoxia組小動脈中膜增厚、中膜和內(nèi)膜層出現(xiàn)藍染的膠原纖維沉積，而Capsaicin＋Hypoxia組的這種病理變化進一步加重（圖2）。與Normoxia組相比，Hypoxia組肺動脈Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達水平明顯增高（P＜0.01），而辣椒素預處理組膠原的表達進一步增高（P＜0.05，表3）。

Fig.2 Effect of capsaicin on collagen accumulation of pulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（Masson×200）

Tab.3 Effect of capsaicin on collagenⅠand collagenⅢ mRNA expression of pulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（±s，n＝8）

Tab.3 Effect of capsaicin on collagenⅠand collagenⅢ mRNA expression of pulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（±s，n＝8）

PA：Pulmonary artery**P＜0.01 vs Normoxia；＃P＜0.05 vs Hypoxia

Group CollagenⅠmRNA level in PA（relative unit，RQ value）CollagenⅢmRNA level in PA（relative unit，RQ value ）Normoxia 1.08±0.36 1.05±0.19 Hypoxia 3.16±0.67** 1.91±0.48**Hypoxia＋capsaicin 4.23±0.84＃ 2.58±0.55＃

2.3 Capsaicin對低氧誘導的PAH大鼠血漿CGRP含量的影響

與Normoxia組相比，低氧能明顯降低大鼠血漿CGRP水平及肺組織 CGRP mRNA的表達（P＜0.01）；而用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進一步降低血漿CGRP水平肺組織CGRP的表達（P＜0.05，表 4）。

2.4 Capsaicin對低氧誘導的 PAH大鼠肺組織CGRP表達的影響

與Normoxia組相比，低氧能明顯降低大鼠血漿CGRP水平及肺組織 CGRP mRNA的表達（P＜0.01）；而用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進一步降低血漿CGRP水平肺組織CGRP的表達（P＜0.05，表 4）。

2.5 Capsaicin對低氧誘導的PAH大鼠肺動脈p-ERK1／2蛋白表達的影響

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，低氧能明顯促進肺動脈p-ERK1／2的表達（P＜0.01），而用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后進一步增加p-ERK1／2的表達（P＜0.05，表 4，圖 3）。

Tab.4 Effect of capsaicin on CGRP level and p-ERK1／2 protein expression of pulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（±s，n＝8）

Tab.4 Effect of capsaicin on CGRP level and p-ERK1／2 protein expression of pulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats（±s，n＝8）

PA：Pulmonary artery；CGRP：Calcitonin gene-related peptide；p-ERK1／2：Phosphorylated ERK1／2**P＜0.01 vs Normoxia；＃P＜0.05 vs Hypoxia

Group CGRP concentration in plasma（pg／ml）α-CGRPmRNA level in lung（relative unit，RQ value） β-CGRPmRNA level in lung（relative unit，RQ value）p-ERK1／2 protein level in PA（p-ERK1／2／ERK1／2）Normoxia 69.95±9.63 1.02±0.23 1.01±0.25 0.99±0.11 Hypoxia 47.11±8.01** 0.68±0.11** 0.65±0.14** 1.98±0.12**Hypoxia＋capsaicin 34.21±9.41＃ 0.44±0.12＃ 0.41±0.13＃ 2.41±0.22＃

Fig.3 Effectof capsaicin on p-ERK1／2 protein expression of pulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension of rats

2.6 CGRP對低氧誘導的PASMCs細胞增殖的影響

BrdU檢測發(fā)現(xiàn)低氧可明顯促進細胞增殖（P＜0.01），而此作用可以明顯的被 ERK1／2抑制劑PD98059所抵消（P＜0.01）。CGRP（1，10，100 nmol／L）可劑量依賴性的抑制低氧誘導的細胞增殖，而CGRP的這些作用可以被CGRP阻斷劑CGRP8-37所抵消（表 5）。

2.7 CGRP對低氧誘導大鼠PASMCs p-ERK1／2蛋白表達的影響

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，低氧能明顯促進PASMCs p-ERK1／2蛋白表達，而此作用可以明顯的被ERK1／2抑制劑 PD98059所抵消（P＜0.01）。CGRP（1，10，100 nmol／L）可劑量依賴性的抑制低氧誘導的 p-ERK1／2蛋白表達，而CGRP8-37可以抵消 CGRP的這些作用（表 5，圖 4）。

2.8 CGRP對低氧誘導的大鼠PASMCs collagenⅠ和collagenⅢmRNA表達的影響

Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，低氧能明顯促進細胞collagenⅠ和collagenⅢ mRNA的表達，而此作用可以明顯的被ERK1／2抑制劑 PD98059所抵消（P＜0.01）。CGRP（1，10，100 nmol／L）可劑量依賴性的抑制低氧誘導的collagenⅠ和collagenⅢ mRNA的表達，而CGRP8-37可以抵消CGRP的這些作用（表5）。

Tab.5 Effect of CGRP on hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery smoothmuscle cells and expression of p-ERK1／2，collagenⅠand collagenⅢ（±s，n＝9）

Tab.5 Effect of CGRP on hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery smoothmuscle cells and expression of p-ERK1／2，collagenⅠand collagenⅢ（±s，n＝9）

PASMCs：Pulmonary arterial smoothmuscle cells；p-ERK1／2：Phosphorylated ERK1／2**P＜0.01 vs Normoxia；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Hypoxia；△△P＜0.01 vs CGRP（100 nmol／L）

Group BrdU incorporation（OD value）p-ERK1／2 protein level in PASMCs（p-ERK1／2／ERK1／2）CollagenⅠmRNA level in PASMCs（relative unit，RQ value）CollagenⅢmRNA level in PASMCs（relative unit，RQ value ）Normoxia 0.29±0.09 1.03±0.10 1.02±0.15 1.04±0.17 Hypoxia 0.91±0.15** 4.48±0.20** 6.66±0.42** 4.75±0.45**Hypoxia＋DMSO 0.94±0.19 4.51±0.18 6.68±0.54 4.73±0.36 Hypoxia＋PD98059（1μmol／L） 0.37±0.13＃＃ 0.13±0.03＃＃ 2.80±0.18＃＃ 1.90±0.24＃＃Hypoxia＋CGRP（1 nmol／L） 0.63±0.12＃ 3.94±0.26＃ 4.85±0.36＃ 3.31±0.27＃Hypoxia＋CGRP（10 nmol／L） 0.58±0.16＃＃ 3.27±0.19＃＃ 4.36±0.42＃＃ 3.03±0.25＃＃Hypoxia＋CGRP（100 nmol／L） 0.44±0.14＃＃ 2.56±0.18＃＃ 3.46±0.27＃＃ 2.76±0.26＃＃Hypoxia＋CGRP8-37（1μmol／L） 0.89±0.12△△ 4.49±0.16△△ 6.55±0.62△△ 4.57±0.38△△

Fig.4 Effect of CGRP on expression of p-ERK1／2 in pulmonary artery smoothmuscle cells

3 討論

肺血管重構是低氧性PAH形成過程中重要的病理基礎，其主要特征包括肺動脈內(nèi)皮細胞增生、腫脹，中膜平滑肌細胞增生、肥大和向合成表型轉化，以及細胞外基質(zhì)的異常沉積［1］。膠原是細胞外基質(zhì)主要組成部分，膠原的增生、沉積在肺血管重構和肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要而又直接的作用。肺血管壁的主要膠原成分是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，Ⅰ型膠原與血管壁的韌性和抗張力有關，Ⅲ型膠原與血管壁的彈性有關［2］。CGRP是由37個氨基酸組成的感覺神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及心血管及肺血管床內(nèi)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠持續(xù)低氧三周能夠引起持續(xù)性PAH并伴隨著血漿CGRP水平的下降［4］，靶向敲除CGRP受體基因能夠加重低氧誘導的PAH［8］。本研究結果提示大鼠低氧3周后大鼠RVSP、mPAP明顯升高，肺小血管肌化程度明顯增強，肺動脈中膜厚度明顯增加，提示肺小血管發(fā)生重構。同時肺動脈Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達明顯增強，提示膠原堆積在低氧性肺血管重構中發(fā)揮重要作用。膠原的堆積將導致肺動脈管壁增厚，管腔變小，血管順應性下降，促進肺動脈高壓的形成。同時我們還發(fā)現(xiàn)，在大鼠低氧性PAH形成的過程中伴隨著CGRP表達的下調(diào)，而用大劑量辣椒素耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠加重上述的病理變化，表明CGRP可能參與了低氧性PAH膠原沉積和血管重構的發(fā)生與發(fā)展。更重要的是我們還發(fā)現(xiàn)，外源性CGRP能夠劑量依賴性地抑制低氧誘導的PASMCs增殖及Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達，而這種抑制作用能夠被CGRP受體阻斷劑CGRP8-37所抵消。提示 CGRP可能通過抑制肺動脈膠原異常堆積參與對低氧性PAH肺血管重構的調(diào)節(jié)作用。

目前低氧性PAH肺動脈膠原沉積的原因還不完全清楚。血管壁過多的膠原主要來自中膜平滑肌細胞和外膜成纖維細胞。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是細胞內(nèi)的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號通路包括：ERK1／2信號通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路及p38 MAPK信號通路，其中ERK1／2在調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖和膠原合成過程中起著重要的作用［9］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，CGRP能夠抑制低氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞（PASMCs）的增殖，其機制與其抑制 ERK1／2信號通路有關［6］。本研究結果也顯示在低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈膠原堆積的同時，肺動脈ERK1／2磷酸化水平明顯增高。同時我們還發(fā)現(xiàn)在低氧誘導PASMCs增殖的同時伴隨著p-ERK1／2表達的上調(diào)，而外源性CGRP在抑制PASMCs膠原表達的同時也劑量依賴性的抑制p-ERK1／2蛋白表達，CGRP的這些作用與 ERK1／2的抑制劑 PD98059相似，也可以被CGRP受體阻斷劑CGRP8-37所抵消。

綜上所述，CGRP能夠抑制低氧誘導的PAH血管重構，其機制可能與抑制ERK1／2的磷酸化，降低肺動脈膠原異常沉積有關。這將為臨床防治低氧性肺動脈高壓提供了新的思路和靶點。但是低氧性PAH只是肺動脈高壓的一種，而CGRP是否通過上述的機制參與非低氧性肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展，目前還不清楚，有待進一步研究。

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