Ac-SDKP對(duì)Ang II誘導(dǎo)的大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞膠原合成的調(diào)節(jié)作用*

汪 婷，孔祥權(quán)，王偉華

（1.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院急診內(nèi)科，安徽蕪湖241000）

N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP），是由Frindel等于1977年首次從胎牛骨髓中提取的一種生理性造血細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子，是一種新的有效的抗器官纖維化的四肽。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）1／2是促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）系統(tǒng)主要的、經(jīng)典的通路，近年來不斷研究證實(shí)ERKl／2參與心、肝、胰、腎、肺等器官纖維化的發(fā)生發(fā)展［1-3］。然而，Ac-SDKP能否通過Ang II介導(dǎo)的ERKl／2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)發(fā)揮其抗血管纖維化的作用，文獻(xiàn)報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)通過觀察Ac-SDKP對(duì)Ang II誘導(dǎo)的血管成纖維細(xì)胞膠原合成及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)的影響，為探討 AcSDKP的抗血管纖維化的可能機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周雄性SD大鼠（皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），DEME培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液，Ang II、Ac-SDKP、PD98059（Bachem AG公司，瑞士），Trizol，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Toyobo公司，日本），Ⅰ型及Ⅲ型膠原單克隆抗體、MMP-2及MMP-9單克隆抗體、TGF-β1單克隆抗體（Sigma公司，美國），肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，波形蛋白單克隆抗體，VIII因子相關(guān)抗原多克隆抗體。

1.2 血管外膜成纖維細(xì)胞的差速貼壁分離培養(yǎng)及鑒定

取6～8周齡雄性SD大鼠（體質(zhì)量160～180 g）頸椎脫臼法處死，分離大鼠胸主動(dòng)脈外膜，切成大小約1mm大小的組織塊，均勻貼于細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上，加入含20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，約6～8周左右可見細(xì)胞圍繞組織塊生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25%胰酶消化后傳代［4］，在倒置顯微鏡下觀察放大的原代和消化傳代后的血管外膜成纖維細(xì)胞，以波形蛋白為第一抗體染色時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見棕褐色陽性顆粒。而以肌動(dòng)蛋白和Ⅷ因子作為第一抗體染色時(shí)，細(xì)胞內(nèi)均無陽性顆粒表達(dá)，表明培養(yǎng)所得到的細(xì)胞為血管外膜成纖維細(xì)胞。將第二代培養(yǎng)的血管成纖維細(xì)胞調(diào)整同步化。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將第二代細(xì)胞以1×108cells／L密度接種于放置無菌蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)試劑，實(shí)驗(yàn)分為4組，即（1）對(duì)照組：為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；（2）Ang II刺激組：10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入10-6mmo l／L的Ang II；（3）AcSDKP作用組：10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入 10-6mmo l／L的 Ang II，同時(shí)加入 10-9mmo l／L Ac-SDKP；（4）PD98059組：10%胎牛血清 DMEM培養(yǎng)液中加入 10-6mmo l／L的 Ang II、10-9mmo l／LAc-SDKP及 25μmmol／L PD98059。

1.4 血管外膜成纖維細(xì)胞膠原蛋白I、膠原蛋白III的檢測(cè)

取培養(yǎng)液上清，用RT-PCR檢測(cè)膠原蛋白I（Col I）、膠原蛋白 III（Col III）mRNA的表達(dá)。以 GAPDH內(nèi)參照（202 bp），引物序列：正向引物 5’-CTCCACGACATACTCAGCA-3’；反向引物 5’-TGTTGCCATCAACGACCCCTT-3’。Col I引物序列（408 bp）：正向引物 5’-AAGGCA ATGCTGAATCGTCC-3’；反向引物5’-TAGCACCTTTGATACCAAACTGC-3’；Col III引物序列 （298 bp）：正 向 引 物 5’-AGAGCGGAGAATACTGGGTTG-3’；反向引物 5’-CAGTGG TATGTAATGTTCTGGGAG-3’產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠至于掃描儀上觀察并照相，用圖像分析軟件分析，以各目的基因與GAPDH的比值表示mRNA水平。

1.5 血管外膜成纖維細(xì)胞MMP-2、TGF-β1的檢測(cè)

用Western blot法將培養(yǎng)的血管外膜成纖維細(xì)胞裂解液裂解，離心，收集上清，按蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定上清中的蛋白含量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（每加樣孔中蛋白上樣量90μg），之后將凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及MMP-2、TGF-β1印跡雜交（單克隆抗體稀釋度均為1∶200，顯色劑為 DAB）。對(duì)硝酸纖維膜上 MMP-2、TGF-β1條帶進(jìn)行灰度掃描（OD值），以對(duì)照組（10%FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)液組）的灰度值為1，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比取值，經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用方差分析和t檢驗(yàn)，并做相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 血管外膜成纖維細(xì)胞鑒定

在倒置顯微鏡下觀察放大的原代和消化傳代后的血管外膜成纖維細(xì)胞，波形蛋白染色為深棕色。

2.2 Col I、Col IIImRNA表達(dá)結(jié)果

如圖1和表1所示Ang II孵育成纖維細(xì)胞24 h后可刺激血管外膜成纖維細(xì)胞合成分泌I、Ⅲ型膠原，與對(duì)照組相比，Ang II組 Col I、Col IIImRNA表達(dá)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ac-SDKP組與 Ang II組相比，Col I、Col IIImRNA水平分別抑制 48.3%、50.5%（P＜0.05），PD98059組則與Ang II組表達(dá)結(jié)果相似，兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.1 Expression of type I、IIIcollagenmRNA in vascular adventitial fibroblasts（RT-PCR）

2.3 Western blot測(cè)定蛋白的表達(dá)結(jié)果

2.3.1 Ac-SDKP對(duì) MMP-2表達(dá)的影響 用 Ang II刺激24 h后，MMP-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，較對(duì)照組分別降低62%（P＜0.05，圖2），Ac-SDKP能顯著的上調(diào)由Ang II抑制的MMP-2蛋白表達(dá)，與Ang II相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PD98059組與Ang II組蛋白表達(dá)相近，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。

Tab.1 Changes of Col Iand Col III relative expression levels in different group（±s，n＝3）

Tab.1 Changes of Col Iand Col III relative expression levels in different group（±s，n＝3）

Ang II：Angiotensin II；Ac-SDKP：N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro；Col：Collagen；PD98059：MAPK inhibitor*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs Ang IIgroup

Group Col I／GAPDH Col III／GAPDH Control 0.28±0.03 0.40±0.11 Ang II 0.87±0.21* 0.93±0.27*Ac-SDKP 0.45±0.07＃ 0.46±0.09＃PD98059 0.69±0.12 0.76±0.18

2.3.2 Ac-SDKP對(duì) TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 AngII能顯著刺激 TGF-β1蛋白表達(dá)水平（P＜0.05，圖 2），與Ang II組相比，Ac-SDKP能抑制由Ang II刺激的TGF-β1蛋白表達(dá)，其 OD值下降41%（P＜0.05）。

Fig.2 Expression of MMP-2，TGF-β1 protein in different group

3 討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展以及疾病的預(yù)后和并發(fā)癥的發(fā)生中，都起著重要的作用。血管緊張素II（Ang II）是RAAS的主要效應(yīng)分子。Ang II及其受體在大多數(shù)疾病中表達(dá)增加，對(duì)心血管的損害作用，主要是導(dǎo)致心血管纖維化。

Ac-SDKP是一種多功能生理調(diào)控因子。早期報(bào)道，Ac-SDKP可以通過阻止原始造血干細(xì)胞進(jìn)入S期，使其靜止在Go期，而抑制造血干細(xì)胞的活性，作為癌癥放療、化療時(shí)的造血保護(hù)劑應(yīng)用于臨床。后來研究發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP在調(diào)節(jié)膠原的合成與代謝方面也發(fā)揮著重要作用［2、3、5-7］，對(duì)抗器官纖維化有著潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。Ac-SDKP也具有顯著的促血管生成作用，Liu等［8］發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP可以誘導(dǎo)血管平滑肌的形成，在血管形成過程中起介導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)中我們通過Ang II誘導(dǎo)的血管外膜的研究顯示，Ang II可刺激血管外膜成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，增加促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)，在體內(nèi)TGF-β1可參與膠原的合成，可以不同方式增加多種細(xì)胞外基質(zhì)的含量，增加成纖維細(xì)胞膠原的表達(dá)，說明Ang II可通過加強(qiáng)其他生長(zhǎng)因子而起作用；而Ac-SDKP組中Col I、Col IIImRNA水平分別抑制48.3%、50.5%，MMP-2水平顯著下調(diào)，說明Ac-SDKP可顯著抑制Ang II刺激的Col I、Col III合成分泌，并通過上調(diào)MMP來增加膠原的降解。通過Ang II組與Ac-SDKP作用組相比較，Ac-SDKP組 TGF-β1的表達(dá)較Ang II組下調(diào)41%，可說明Ac-SDKP可下調(diào)Ang II刺激的 TGF-β1的表達(dá)，降低 Ang II與 TGF-β1的協(xié)同作用［10］。

ERKl／2信號(hào)級(jí)聯(lián)通路是一條可被廣泛激活的MAPK通路，它能將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，引起胞內(nèi)特異性蛋白的表達(dá)譜變化，從而影響細(xì)胞的功能和作用，是許多胞外刺激的共同途徑。ET、Ang II、TGF-β1、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）等均能激活ERKl／2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Rhaleb等［9］對(duì) ERKl／2通路在Ac-SDKP抑制內(nèi)皮素-1（ET-1）誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞DNA和膠原蛋白表達(dá)中的作用進(jìn)行了研究，推測(cè)Ac-SDKP對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖及膠原表達(dá)的抑制作用部分依賴于ERKl／2通路的阻斷。本實(shí)驗(yàn)中我們通過ERKl／2通道阻斷劑來觀察Ac-SDKP對(duì)ERK1／2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)在血管纖維化形成過程中的作用，結(jié)果顯示，PD98059組中Col I、Col IIImRNA表達(dá)，MMP-2及 TGF-β1蛋白表達(dá)均與 Ang II組相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PD98059阻斷Ac-SDKP作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示，Ac-SDKP可能抑制Ang II刺激的ERKl／2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。

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