Tubedown-1 與眼部新生血管性疾病

秦秀虹，范松濤，張珍珍，盧建民，張晨曦

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 眼科，遼寧 大連116011;2.上海交通大學(xué) 附屬上海市第一人民醫(yī)院 眼科，上海200080)

Tubedown-1 是最早在2000年由Gendron 等［1］發(fā)現(xiàn)的，是從胚胎內(nèi)皮細(xì)胞叢(embryonic endothelial cells，IEM)分離出來的一種新的N-末端乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-terminal acetyltransterases，NATs)，其分子量為69 kD，為包含594 個氨基酸的親水蛋白質(zhì)。Tubedown-1 主要存在于發(fā)育的卵黃囊血島、心臟、肝臟血管的內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞;成人的心房內(nèi)膜、卵黃囊血管、骨髓的血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓腔的造血組織以及閉鎖卵泡血管床，在正常成人眼中主要分布于角膜緣血管、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮中［1］。Tubedown-1 亦被稱為Narg1(NMDA receptor -regulated protein 1)或mNat1(menage a trois 1)，能夠抑制血管過度增生及滲漏而保護(hù)視網(wǎng)膜正常功能［2］。目前研究表明其對眼部脈管系統(tǒng)的發(fā)育及缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜新生血管形成及發(fā)展分別有調(diào)控及抑制作用，現(xiàn)介紹tubedown -1 的特性及在脈管系統(tǒng)發(fā)育中的作用及與眼科疾病的關(guān)系及相關(guān)進(jìn)展。

1 Tubedown-1 的基本結(jié)構(gòu)及乙?；饔?/h2>

Tubedown - 1 是酵母菌NAT1(N - terminal acetyltransterase，NAT1)氨基末端乙酰轉(zhuǎn)移酶的同源異型體，Gendron 等［1］的研究揭示了大部分tubedown-1 序列與啤酒酵母NAT1 相一致(28%相同，4 7% 的陽性氨基酸置換率)。啤酒酵母包含3種NATs:NATA、NATB 和NATC。NATA 同時需要催化亞基Ard1p(arrest defective 1 protein)和調(diào)節(jié)亞基Nat1p(N α –terminal acetyltransferase subunit)才能發(fā)揮活性，具有乙酰化含絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸末端蛋白質(zhì)的功能［3］。在真核生物，Nat1p同系物蛋白質(zhì)涉及幾個關(guān)鍵生物學(xué)現(xiàn)象，如組織發(fā)育、細(xì)胞增殖、癌癥。NATB 包括催化亞基NAT3p［4］和調(diào)節(jié)亞基Mdm20p，也是NATB 活性所必須的，能乙?；鞍彼?谷氨酸或蛋氨酸-天冬氨酸末端蛋白質(zhì)以及蛋氨酸-天門冬氨酸和蛋氨酸-蛋氨酸蛋白亞類，NATB 乙酰化酵母菌2 個基本的蛋白質(zhì)，即肌動蛋白和肌凝蛋白。NATC 包括Mak3p、Mak10和Mak31p 3 個亞基，3 種亞基均是NATC 活性所必需，NATC 乙?；械鞍彼?異亮氨酸、蛋氨酸-亮氨酸、蛋氨酸-色氨酸或蛋氨酸-苯丙氨酸的蛋白質(zhì)［5］。

氮末端乙?；钦婧松镒钇胀ǖ鞍仔揎椫?，出現(xiàn)在大約80% ～90%的不同種類的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，50%的酵母蛋白，是一種不可逆的酶催化反應(yīng)，即氮末端殘基，例如絲氨酸殘基、丙氨酸殘基、蛋氨酸殘基等接受乙酰CoA 乙?；Ｒ阴；揎椫泻土苏姾桑@些正電荷能影響蛋白質(zhì)功能、穩(wěn)定性、與其他分子的相互作用或其他后來的修飾，如磷酸化［5-6］。這個反應(yīng)是由一系列乙酰轉(zhuǎn)移酶催化的，在原核生物、古細(xì)菌、真核生物等所有領(lǐng)域中均發(fā)現(xiàn)這些乙酰轉(zhuǎn)移酶。研究表明，tubedown -1 與NAT1 同源性包括一個與乙酰CoA 同源的NAT1 區(qū)域，這個乙酰CoA 能結(jié)合組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(GCN5)家族乙酰轉(zhuǎn)移酶序列［1］，證明tubedown -1與NAT1 氨基末端乙酰轉(zhuǎn)移酶同源，并通過對其他蛋白質(zhì)的乙酰化修飾而產(chǎn)生作用的。

2 Tubedown-1 的表達(dá)分布與胚胎發(fā)育

Tubedown-1 在組織發(fā)育過程中的內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞中均受到調(diào)節(jié)，例如在卵黃囊血島、心臟、肝臟血管的內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞;在成人，除了心房內(nèi)膜、卵黃囊血管、骨髓的血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓腔的造血組織以及閉鎖卵泡血管床，tubedown-1 在大多數(shù)器官低表達(dá)或不表達(dá)。而Tubedown-1 在正常成人眼中主要分布于角膜緣血管、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮中，在周細(xì)胞中無表達(dá)或僅有少量表達(dá)［1］。

Tubedown-1 表達(dá)水平的分布在胚胎發(fā)育過程中是不斷變化的。Tubedown-1 的表達(dá)在大多數(shù)血管發(fā)育的早期至中期達(dá)到高峰，并在成熟晚期水平下調(diào)，表明其可能參與胚胎發(fā)生過程中血管成熟階段的調(diào)節(jié)，有研究表明，tubedown -1 在早期卵黃囊脈管系統(tǒng)形成過程中表達(dá)最高，在卵黃脈管系統(tǒng)血管發(fā)生的發(fā)育晚期則下調(diào)［1］，證明了這個觀點(diǎn)。Gendron 等［1］在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，tubedown -1 在未受刺激的IEM 細(xì)胞中呈高表達(dá)，當(dāng)IEM 細(xì)胞受到堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)刺激形成毛細(xì)血管管狀結(jié)構(gòu)時，其表達(dá)水平下調(diào)。Tubedown-1 的分布與表達(dá)調(diào)節(jié)的研究提示這個新的乙酰轉(zhuǎn)移酶可能參與了血管調(diào)節(jié)、造血發(fā)生以及生理血管發(fā)生的過程。

同時有學(xué)者發(fā)現(xiàn)小鼠玻璃體血管表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transforming growth factor -β2 TGF -β2)的定向失活，并呈現(xiàn)出類似于人永久性胚胎血管的病理改變，即玻璃體無法塑型并有異常結(jié)構(gòu)殘留。在研究正常發(fā)育的玻璃體脈管系統(tǒng)及TGF -β2 - / -小鼠眼的玻璃體血管的tubedown -1 表達(dá)過程中，發(fā)現(xiàn)TGF -β2 - / -小鼠眼玻璃體血管內(nèi)皮細(xì)胞核表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)并顯示出活化的促分裂原活化蛋白激酶磷光體-P42/44MAPK(P42/44)表達(dá)增高，同時表達(dá)4 型膠原，TGF-β2 - / -小鼠玻璃體血管結(jié)構(gòu)紊亂，提示血管結(jié)構(gòu)破壞和血管基片分解。此外，TGF-β2 - / -小鼠玻璃體血管缺乏周細(xì)胞標(biāo)記(CD13，α 平滑肌肌動蛋白)的表達(dá)，并顯示了其超微結(jié)構(gòu)的改變與周細(xì)胞變性相一致。當(dāng)維持內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)的表達(dá)時，TGF -β2 - / -小鼠玻璃體血管積聚，而tubedown -1 表達(dá)的顯著下降［7］，說明tubedown-1 能抑制體外毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成，并且能在發(fā)育中的玻璃體血管退化之前延緩玻璃體血管的形成。因此，tubedown - 1 可能參與調(diào)節(jié)TGF -β2 - / -的正常玻璃體脈管系統(tǒng)的發(fā)育，并與玻璃體胚胎發(fā)育血管的生長調(diào)控相關(guān)。

3 Tubedown-1 在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的作用

在研究tubedown-1 維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程中，Paradis H 等［8］研究了tubedown -1 蛋白復(fù)合物的自然特性，確定并揭示了tubedown -1 與皮層肌動蛋白及細(xì)胞骨架蛋白F-actin 共同位于細(xì)胞漿及所培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)，皮層肌動蛋白被認(rèn)為能與F-actin 相互作用，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞滲透性而維持內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。將內(nèi)皮細(xì)胞的tubedown -1 敲除后將導(dǎo)致Ard1 蛋白表達(dá)被抑制，顯著增加細(xì)胞滲透性。Gendron 等［9］研究了胡瓜魚眼組織對滲透壓的適應(yīng)，胡瓜魚把自身的滲透壓變成與周圍海水幾乎相同來御寒。研究人員發(fā)現(xiàn)玻璃體液溫度在0.5 ℃以下的胡瓜魚其甘油及滲透壓較玻璃體溫度在8 ～10 ℃者顯著增加;與8 ～10 ℃物種相比，0.5 ℃以下的胡瓜魚小動靜脈網(wǎng)及脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞連接區(qū)域tubedown -1 蛋白表達(dá)水平顯著增加，認(rèn)為tubedown-1 蛋白的變化能夠調(diào)節(jié)眼內(nèi)液體和血漿之間的蛋白通路。這些實(shí)驗(yàn)均說明tubedown -1 在血管中的滲透活性對維持血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

4 Tubedown-1 與眼新生血管

與眼新生血管有關(guān)的疾病能引起視力喪失和致盲。其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是能引起眼部新生血管的疾病之一，并以視網(wǎng)膜微血管漸進(jìn)性改變?yōu)樘卣?，最終進(jìn)展為視網(wǎng)膜無灌注、滲透性增強(qiáng)以及視網(wǎng)膜血管的病理性增殖［10］。目前，高水平的血管源性因子被認(rèn)為是導(dǎo)致血管增生的原因。一些血管源性生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、bFGF、胰島素樣生長因子-1(insulin -like growth factors-1，IGF-1)等，以及細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)成分均能導(dǎo)致PDR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)病理性新生血管形成［11］，而tubedown-1 是近年新發(fā)現(xiàn)的能抑制眼底新生血管形成相關(guān)的細(xì)胞因子。

Tubedown-1 于成人大多數(shù)血管未見表達(dá)，但在眼內(nèi)血管則持續(xù)表達(dá);在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)情況下，tubedown-1 于正常成人眼內(nèi)血管呈高水平表達(dá)。Gendron 等［1］以體外生長的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮毛細(xì)血管叢為模型，應(yīng)用免疫印跡和免疫組化方法研究成人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)情況下正常人視網(wǎng)膜組織中tubedown-1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)tubedown -1 高表達(dá)于正常人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮。國外研究表明tubedown -1亦表達(dá)于獼猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜來源的內(nèi)皮細(xì)胞叢，并且，當(dāng)這些內(nèi)皮細(xì)胞叢生長為毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)時，則tubedown-1 表達(dá)下調(diào)［11］，這些證據(jù)表明tubedown-1的表達(dá)可能參與維持眼血管穩(wěn)態(tài)，因此推測tubedown-1 具有延緩正常視網(wǎng)膜毛細(xì)血管生長的作用。然而，在PDR 形成新生血管時，tubedown -1表達(dá)被抑制，其延緩正常視網(wǎng)膜毛細(xì)血管生長的作用被消除，最終導(dǎo)致糖尿病患者視網(wǎng)膜新生血管形成。Wall DS 等［12］應(yīng)用條件性敲除血管內(nèi)皮細(xì)胞tubedown-1 小鼠模型，研究小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮中tubedown-1 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)tubedown -1 基因敲除小鼠所表現(xiàn)出的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管形成、視網(wǎng)膜前膜、視網(wǎng)膜內(nèi)纖維血管損傷與增殖型視網(wǎng)膜病變相似。Tubedown-1 基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)特征是視網(wǎng)膜前膜形成，包括視網(wǎng)膜新生血管，纖維血管增殖，視網(wǎng)膜晶狀體粘附等;tubedown -1 基因的敲除不僅導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)、類型異常，還增加了視網(wǎng)膜異常血管及毛細(xì)血管的數(shù)量;其視網(wǎng)膜損傷嚴(yán)重程度及視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織厚度隨著tubedown -1 抑制時間的延長而增加［12］，這些結(jié)果說明tubedown-1 表達(dá)于正常視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，但是在PDR病人的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)被特異地抑制，提示tubedown-1 的持續(xù)表達(dá)對視網(wǎng)膜血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抑制成人視網(wǎng)膜新生血管形成至關(guān)重要，進(jìn)一步說明tubedown-1 可能是一種新的血管生成抑制因子，能抑制病理情況下視網(wǎng)膜新生血管的生成，其表達(dá)缺失能促進(jìn)新生血管的增殖。

另外，還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)tubedown -1 在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成的小鼠模型和第3 期的人未成熟兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)樣本中表達(dá)受到抑制;tubedown -1 在高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜病變的增殖性視網(wǎng)膜血管中表達(dá)明顯降低，并伴隨血管肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記抗平滑肌抗體(anti - smooth muscle antibodym，ASMA)及增殖的細(xì)胞標(biāo)記PCNA 表達(dá)增加，這些結(jié)果說明此模型中視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮中tubedown -1 的表達(dá)抑制與增殖的細(xì)胞核抗原和平滑肌肌動蛋白表達(dá)增加相關(guān)聯(lián)，而ASMA 被認(rèn)為參與了視網(wǎng)膜損傷形成，具有收縮力導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，說明tubedown -1 可能通過抑制ASMA 抑制視網(wǎng)膜損傷。而tubedown -1 蛋白在人ROP 的3 期樣本的玻璃體新生血管無表達(dá)［13］，表明tubedown-1 的表達(dá)可能在ROP 病理過程被抑制，由此可見tubedown -1 在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)抑制可能是ROP 視網(wǎng)膜血管增殖的促進(jìn)因素，進(jìn)一步說明tubedown -1 是一種新生血管抑制因子，能抑制病理性新生血管的增殖，其缺失或表達(dá)下降均能引起血管增殖性疾病的發(fā)生。

Gendron 等［2］建立了內(nèi)皮細(xì)胞tubedown -1 基因敲除小鼠模型，并與成年小鼠及人進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)眼內(nèi)后極部內(nèi)皮細(xì)胞tubedown -1 的表達(dá)隨年齡增加而逐漸減少，并與老年小鼠脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜組織的病理性改變相關(guān)。在人類，無眼底病變的老年人其tubedown-1 在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的表達(dá)較青年人輕度降低。然而，在老年性黃斑變性(age related macular degeneration，AMD)患者的脈絡(luò)膜血管中tubedown-1 表達(dá)顯著降低。在tubedown -1 敲除眼視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞和Bruch’s 膜以及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的超微異常變化同樣發(fā)生于AMD 患者，說明隨著年齡的增長，視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管中tubedown -1 表達(dá)顯著降低可能參與了AMD 病理的發(fā)生與發(fā)展，而AMD 是一種黃斑區(qū)新生血管增生性病變，同樣證明了tubedown-1 可能是一種新生血管抑制因子，抑制病理性新生血管的增殖。

此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)正常成人血管中tubedown -1的表達(dá)與視網(wǎng)膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的表達(dá)相平行［14］。PEDF是一種抗血管生成的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，由正常的視網(wǎng)膜色素上皮產(chǎn)生，在氧誘導(dǎo)的小鼠和大鼠的視網(wǎng)膜新生血管形成時可見PEDF 的表達(dá)水平降低，給予缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠PEDF能預(yù)防tubedown-1 基因敲除小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成［15］。在人PDR 視網(wǎng)膜組織中是否存在PEDF的表達(dá)下降及在這個時期tubedown -1 是否能直接或間接地被PEDF 調(diào)節(jié)尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

因此，tubedown-1 是一種血管生長抑制因子，能抑制眼部疾病新生血管的形成。

5 Tubedown-1 導(dǎo)致血管增殖的機(jī)制

Tubedown-1 缺失能導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管增殖的機(jī)制包括:(1)影響涉及通過乙?；饔谜{(diào)節(jié)血管生成的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性。乙酰轉(zhuǎn)移酶Ard1 能結(jié)合NAT1 同系物tubedown-1，并在哺乳動物缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor -1α，HIF -1α)的定向降解中起作用［16］。HIF-1α 在低氧情況下調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)，并能通過對VEGF 誘導(dǎo)促進(jìn)血管增殖［17］。一個或多個乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物結(jié)合配體受到抑制或缺失可能分解和改變復(fù)合物活性。乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的分解涉及Ard1 或tubedown -1能促進(jìn)HIF-1α 的穩(wěn)定及細(xì)胞因子產(chǎn)物，能促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成。(2)視網(wǎng)膜血管乙酰肝素糖蛋白(heparansulfateproteogly cans，HSPG)表達(dá)的下調(diào)。Tubedown-1 是視網(wǎng)膜血管基底膜HSPG 表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子，因?yàn)閠ubedown -1 表達(dá)的抑制導(dǎo)致來源于視網(wǎng)膜血管基底膜HSPG 的丟失。盡人皆知，血管基底膜的增厚和改變與增殖性視網(wǎng)膜病變有關(guān)?；啄?basement membrane，ECM)組成在內(nèi)皮細(xì)胞和其下的結(jié)締組織之間提供了一個組織特異的屏障，并參與控制血管發(fā)生?；啄こ煞值淖兓艽龠M(jìn)血管基底膜的破壞和分解，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖?；啄SPG 的丟失伴隨糖尿病視網(wǎng)膜病變血管的瓦解。并且，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜顯示了HSPG 基底膜蛋白多糖的合成和表達(dá)降低［18］。通過了解tubedown-1 作用的相關(guān)機(jī)制及途徑，就有望建立治療視網(wǎng)膜新生血管疾病的新方法。

6 結(jié) 語

綜上所述，tubedown-1 在眼脈管系統(tǒng)的發(fā)育的調(diào)控、維持視網(wǎng)膜血管的穩(wěn)態(tài)及對視網(wǎng)膜新生血管的抑制有重要作用，是一種新生血管抑制因子。新生血管的形成是受多種因素共同調(diào)控的，tubedown-1是其中之一，雖然僅針對一種因子進(jìn)行治療，不能完全控制新生血管疾病的病變，但可以延緩病變的發(fā)展和惡化，tubedown-1 蛋白的表達(dá)和或活性的恢復(fù)能為治療增殖性視網(wǎng)膜病變提供一個新的方法。目前對tubedown-1 的性質(zhì)及作用的了解還所知甚少，其在眼新生血管化及發(fā)育的調(diào)控的具體作用機(jī)制、以及其與其他生長因子如PEDF、VEGF 等的關(guān)系還有待于進(jìn)一步深入研究。

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