miRNAs對腸道健康的調(diào)控作用及機理

陶 新 徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

miRNAs是一類長約18～26 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，作為細胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，影響著機體內(nèi)部幾乎所有的信號通路。它是體內(nèi)最大的一類基因表達調(diào)控因子，可調(diào)控機體內(nèi)超過1/3蛋白編碼基因的表達，在動物的生長、發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。miRNAs參與了干細胞的自我更新和多向分化[1]，與免疫、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌和心血管等系統(tǒng)的發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。miRNAs的表達模式具有時序性和組織特異性，但大多數(shù)的miRNAs在相關(guān)物種間又高度保守，提示它們在關(guān)鍵細胞進程如應(yīng)激適應(yīng)能力和激素信號傳導(dǎo)中起著重要作用[2]。目前有關(guān)miRNAs在腸道組織中的報道主要集中在其差異性表達與結(jié)直腸癌[3-5]、炎癥性腸病(IBD)[6]、腸易激綜合征(IBS)[7]和囊性纖維化(CF)[8]等腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系的研究。然而越來越多的研究結(jié)果表明，miRNAs的表達同樣對腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)的發(fā)育進程、正常維持以及腸道各種功能的發(fā)揮等起著重要調(diào)控作用。因此，全面而深入地了解miRNAs在腸道組織中的表達和調(diào)控機理，對于深層次挖掘和揭示影響機體腸道健康的分子機理具有非常重要的科學意義。

1 miRNAs在腸道組織中的表達

miRNAs在腸道組織中的種類和表達均較為豐富。其中，在人類腸道中的表達多來自對腸道成熟細胞系的研究結(jié)果。Cummins等[9]通過利用miRNA基因表達系列分析技術(shù)對結(jié)直腸癌細胞株HCT116、DLD1、RKO、Caco-2 和 SW480 等的研究，在人的結(jié)直腸細胞中共鑒定了200個成熟的已知 miRNAs和133個新發(fā)現(xiàn)的候選 miRNAs。隨著miRNAs芯片及高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得不同動物腸道中越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。在鼠上，McKenna等[10]通過高通量測序技術(shù)在小鼠空腸組織黏膜層檢測到了1 094個成熟miRNAs序列，其中得到證實的miRNAs表達序列有545個，進一步分析結(jié)果表明，這些miRNAs分屬540個miRNAs家族，并且涵蓋了574個已知前體miRNAs(pre-miRNAs)中的339個。通過進一步比較小鼠空腸黏膜與肝、胰組織的miRNAs轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了65個在小腸黏膜特異性表達的miRNAs[11]。在 豬 上，Sharbati-Tehrani 等[12]首 先通過多聯(lián)體克隆的方法在31日齡仔豬空腸和回腸組織鑒定了11種miRNAs，并進一步利用miR-Q方法驗證了 miR-21、miR-24、miR-181a、miR-326、miR-423-3p、miR-484和miR-143在豬腸道組織中的表達 等 利用miRNA深度測序技術(shù)結(jié)合miRNAome芯片檢測方法，研究了31日齡仔豬整個腸道組織(十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸)的miRNAs表達圖譜，共發(fā)現(xiàn)332個miRNAs表達序列，其中201個miRNAs為在豬腸道中新發(fā)現(xiàn)的候選miRNAs。通過對miRNAs序列進行信號通路分析表明，它們可能在仔豬腸道各相關(guān)功能方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，Coutinbo等[15]對30日齡胎牛小腸組織進行了miRNAs測序，共檢測到了559個miRNAs序列，其中187個在小腸組織中呈特異性表達。

2 miRNAs對腸上皮細胞增殖、分化和凋亡的影響

腸道上皮細胞作為腸道上皮組織發(fā)揮消化、吸收、內(nèi)外分泌等的主要功能細胞及構(gòu)成免疫屏障的重要組成部分，其增殖、分化和凋亡的程度直接與腸道的健康密切相關(guān)，而miRNAs在一定程度上主宰了腸道上皮細胞的命運。在Dicer1酶基因(該基因編碼了腸道上皮miRNAs生物合成的必需酶)缺失的小鼠體內(nèi)，其腸上皮組織結(jié)構(gòu)紊亂，空腸和結(jié)腸部位的杯狀細胞數(shù)量降低，隱窩細胞凋亡顯著增加，空腸段的細胞遷移率增加[10]。在斑馬魚胚胎上的研究發(fā)現(xiàn)，雖然miR-145在其腸道平滑肌中高度表達，但改變其表達的水平除了導(dǎo)致了斑馬魚腸道平滑肌功能的缺陷，還致使其上皮組織形態(tài)發(fā)育未成熟以及堿性磷酸酶表達缺失等腸道發(fā)育異常狀態(tài)，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-145是通過其靶標轉(zhuǎn)錄因子 Gata家族中的gata6起作用的[16]。通過研究未分化細胞株Caco2-BBE和已分化細胞株HT29-Cl.19A的miRNAs表達差異，Dalmasso 等[17]認為 miRNAs在決定腸道上皮細胞的特有生理功能方面起了一定作用。Hino等[18]研究表明，參與動物腸道上皮組織細胞分化過程的miRNAs是通過具有種特異性的轉(zhuǎn)錄因子起作用的，且這些miRNAs能夠以組織特異性的方式調(diào)控其靶基因的表達。Liao等[19]通過分離、培養(yǎng)小鼠的隱窩細胞，并利用類胰島素生長因子-1(IGF-1)誘導(dǎo)細胞增殖24 h后，采用miRNA芯片技術(shù)檢測到了多個miRNAs的差異表達，特別是miR-103的表達極顯著下調(diào)。進一步通過熒光素酶和免疫印跡試驗證實miR-103是通過作用于其靶基因，包括細胞周期蛋白E1(CCNE1)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶-2(CDK2)和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-1(CREB1)等參與了細胞周期G1/S的部分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，miR-16也通過抑制細胞周期G1/S的某些特定調(diào)控因子的表達影響了腸道上皮細胞的增殖[20]。

3 miRNAs與腸道黏膜免疫及抗炎作用

miRNAs同樣也是腸道黏膜免疫的一類關(guān)鍵調(diào)控因子。在Dicer1酶滅活的小鼠結(jié)腸上皮組織的杯狀細胞數(shù)量明顯減少，且其特異性輔助性T細胞2(Th2)的影響因子抵抗素樣分子家族β(RELMβ)也大量降低，從而導(dǎo)致小鼠腸道黏膜免疫力缺失，抗寄生蟲感染能力下降。進一步研究表明，miRNAs通過調(diào)控杯狀細胞的分化和促進Th2的抗寄生蟲感染的免疫反應(yīng)在腸道免疫中發(fā)揮作用[21]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-375在腸道上皮-免疫系統(tǒng)作用的發(fā)揮中是必不可少的[22]。Dkhil等[23]研究了球蟲感染對Balb/c小鼠腸道m(xù)iRNA表達圖譜的影響，結(jié)果表明，口服乳突艾美耳球蟲(E.papillata)4 d后，在小鼠空腸的634個miRNAs中發(fā)現(xiàn) miR-1959、miR-21、miR-203和 miR-M23-1-5P 4個miRNAs的表達顯著上調(diào)。進一步研究表明，大蒜提取物能夠使球蟲感染的小鼠空腸組織中上述前3個上調(diào)表達的miRNAs表達豐度相應(yīng)回調(diào)，同時 miR-142-5P、miR-15A、miR-10A、miR-29B、miR-1902、miR-125A-5P、let-7E、miR-148A、miR-130A、miR-10B和 miR-93等miRNAs表達上調(diào)[24]。利用 Caco2-BBE細胞株進行研究證實，miR-92b、miR-7和miR-802均分別通過作用于其靶基因腸道肽轉(zhuǎn)運蛋白(PepT1)、CD98和血管緊張素Ⅱ-Ⅰ型受體(AT1R)的 3'非翻譯區(qū)域(UTR)，而最終在腸道抗炎作用中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[25-27]。

4 miRNAs在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用

腸道組織的特征之一是富有與生物體共生的龐大微生物區(qū)系，動物一出生即有細菌定植，腸道上皮細胞可與高達1013的腸道菌群共生。然而，暴露于如此龐大的微生物群體，腸道上皮細胞是如何與其共生的呢?腸道穩(wěn)態(tài)又是如何被維持的呢?研究證實，miRNAs的表達對于維持腸道穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。Chassin等[28]研究表明，在大量細菌定植后，腸道m(xù)iR-146a的上調(diào)表達避免了細菌或者細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)對腸道黏膜的損傷，miR-146a主要通過翻譯抑制和蛋白降解的方式作用于Toll樣受體(TLR)信號分子白細胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK1)發(fā)揮了這種保護功能。但miR-146a的這種調(diào)控作用卻不是腸道保持穩(wěn)態(tài)唯一的機制，缺乏miR-146a表達的小鼠在出生后的前幾周仍然是健康的[29]。與無菌小鼠相比，微生物的定植分別使小鼠的回腸和結(jié)腸組織的1個(miR-298)和8個miRNAs(miR-128、miR-200c* 、miR-342-5p、miR-465c-5p、miR-466d-3p、miR-466d-5p、miR-665、miR-683)異 常 表達[25]。Singh 等[30]在無菌和正常雄性小鼠的盲腸組織中檢測到了334個miRNAs的表達，其中包括16個在無菌小鼠盲腸異常表達的miRNAs。上述研究證實，腸道內(nèi)源微生物區(qū)系顯著影響了腸道m(xù)iRNAs的表達特征，提示miRNAs在共生菌調(diào)控腸道屏障和腸道穩(wěn)態(tài)過程中起到了一定作用。

此外，有研究證實，腸道m(xù)iRNAs還參與了腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及在抗應(yīng)激方面發(fā)揮了調(diào)控作用。Liao等[31]利用載體構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、實時定量PCR及免疫印跡等技術(shù)研究表明，miR-584顯著降低了Caco-2細胞和哺乳期小鼠小腸組織中的內(nèi)源性乳鐵蛋白受體蛋白的表達，提示miRNAs可能參與了新生動物營養(yǎng)代謝過程的調(diào)控。Yu等[32]研究了熱應(yīng)激對大鼠小腸組織中miRNAs和mRNAs表達圖譜的影響。試驗在對Sprague-Dawley雄性大鼠進行每日2 h，連續(xù)10 d的熱應(yīng)激處理后，通過組織形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激試驗結(jié)束后3 d對小腸的空腸段損傷最嚴重。進一步利用mRNAs芯片檢測發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激大鼠空腸組織中的270個基因上調(diào)和122個基因下調(diào);miRNAs芯片檢測發(fā)現(xiàn)了18個miRNAs上調(diào)和11個miRNAs下調(diào)。而且通過生物信息學分析表明，異常表達的mRNAs和miRNAs之間呈負相關(guān)。

5 小結(jié)

在畜禽養(yǎng)殖過程中，保障畜禽自身健康是進行動物生產(chǎn)的基本要素，而畜禽的健康狀況則主要取決于其胃腸道的健康，特別是幼畜的腸道發(fā)育和成熟被認為是制約其快速生長的關(guān)鍵因素。因此，從長遠角度來講，徹底闡明影響畜禽腸道發(fā)育和成熟的分子機制對于促進畜禽生產(chǎn)具有極為重要的理論意義。而現(xiàn)有研究表明，miRNAs在動物腸道的發(fā)育、成熟和健康等多個方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。因此，結(jié)合現(xiàn)有的各種研究手段和方法深入探討miRNAs在幼畜的腸道發(fā)育和成熟過程中的作用，以及在各種應(yīng)激或病原感染條件下，腸道組織中差異表達的特異性 miRNAs、miRNAs基因簇或miRNAs家族的協(xié)同作用及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或信號通路，有望成為畜禽健康養(yǎng)殖基礎(chǔ)研究的一個新熱點。

[1]XU N，PAPAGIANNAKOPOULOS T，PAN G，et al.MicroRNA-145 regulates OCT4，SOX2，and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J].Cell，2009，137:647-658.

[2]LEUNG A K L，SHARP P A.MicroRNAs:a safeguard against turmoil?[J].Cell，2007，130:581-585.

[3]PIEPOLI A，TAVANO F，COPETTI M，et al.miRNA expression profiles identify drivers in colorectal and pancreatic cancers[J].PLoS One，2012，7:e33663.

[4]SARVER A L，F(xiàn)RENCH A J，BORRALHO P M，et al.Human colon cancer profiles show differential microRNA expression depending on mismatch repair status and are characteristic of undifferentiated proliferative states[J].BMC Cancer，2009，9:401.

[5]ZHANG B，WANG X K，WANG Y.Altered gene expression and miRNA expression associated with cancerous IEC-6 cell transformed by MNNG[J].Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2009，28:56.

[6]OLARU A V，SELARU F M，MORI Y，et al.Dynamic changes in the expression of microRNA-31 during inflammatory bowel disease-associated neoplastic transformation[J].Inflammatory Bowel Diseases，2011，17:221-231.

[7]ZHOU Q Q，SOUBA W W，CROCE C M，et al.MicroRNA-29a regulates intestinal membrane permeability in patients with irritable bowel syndrome[J].Gut，2010，59:775-784.

[8]BAZETT M，PAUN A，HASTON C K.MicroRNA profiling of cystic fibrosis intestinal disease in mice[J].Molecular Genetics and Metabolism，2011，103:38-43.

[9]CUMMINS J M，HE Y P，LEARY R J，et al.The colorectal microRNAome[J].Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of A-merica，2006，103:3687-3692.

[10]MCKENNA L B，SCHUG J，VOUREKAS A，et al.MicroRNAs control intestinal epithelial differentiation，architecture，and barrier function[J].Gastroenterology，2010，139:1654-1664.

[11]GAO Y，SCHUG J，MCKENNA L B，et al.Tissuespecific regulation of mouse microRNA genes in endoderm-derived tissues[J].Nucleic Acids Research，2011，39:454-463.

[12]SHARBATI-TEHRANIS， KUTZ-LOHROFF B，SCHOLVEN J，et al.Concatameric cloning of porcine microRNA molecules after assembly PCR[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，375:484-489.

[13]SHARBATI-TEHRANIS， KUTZ-LOHROFF B，BERGBAUER R，et al.miR-Q:a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample[J].BMC Molecular Biology，2008，9:34.

[14]SHARBATI S，F(xiàn)RIEDL?NDER M R，SHARBATI L，et al.Deciphering the porcine intestinal microRNA transcriptome[J].BMC Genomics，2010，11:275.

[15]COUTINBO L L，MATUKUMALLI L K，SONSTEGARD T S，et al.Discovery and profiling of bovine microRNAs from immune-related and embryonic tissues[J].Physiological Genomics，2007，29:35-43.

[16]ZENG L，CARTER A D，CHILDS S J.miR-145 directs intestinal maturation in zebrafish[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106:17793-17798.

[17]DALMASSO G，NGUYEN H T T，YAN Y T，et al.MicroRNAs determine human intestinal epithelial cell fate[J].Differentiation，2010，80:147-154.

[18]HINO K，TSUCHIYA K，F(xiàn)UKAO T，et al.Inducible expression of microRNA-194 is regulated by HNF-1α during intestinal epithelial cell differentiation[J].RNA，2008，14:1433-1442.

[19]LIAO Y L，L?NNERDAL B.Global microRNA characterization reveals that miR-103 is involved in IGF-1 stimulated mouse intestinal cell proliferation[J].PLoS One，2010，5:e12976.

[20]BALAKRISHNAN A，STEARNS A T，PARK P J，et al.MicroRNA miR-16 is anti-proliferative in enterocytes and exhibits diurnal rhythmicity in intestinal crypts[J].Experimental Cell Research，2010，316:3512-3521.

[21]GOTO Y，KIYONO H.Epithelial cell microRNAs in gut immunity[J].Nature Immunology，2011，12:195-197.

[22]BITON M，LEVIN A，SLYPER M，et al.Epithelial microRNAs regulate gut mucosal immunity via epithelium-T cell crosstalk[J].Nature Immunology，2011，12:239-246.

[23]DKHIL M，ABDEL-BAKI A A，DELI C'D，et al.Eimeria papillata:upregulation of specific miRNA-species in the mouse jejunum[J].Experimental Parasitoligy，2011，127:581-586.

[24]AL-QURAISHY S，DELIC D，SIES H，et al.Differential miRNA expression in the mouse jejunum during garlic treatment of Eimeria papillata infections[J].Parasitology Research，2011，109:387-394.

[25]DALMASSO G，NGUYEN H T T，YAN Y T，et al.Microbiota modulate host gene expression via microRNAs[J].PLoS One，2011，6:e19293.

[26]NGUYEN H T T，DALMASSO G，YAN Y T，et al.MicroRNA-7 modulates CD98 expression during intestinal epithelial cell differentiation[J].The Journal of Biological Chemistry，2010，285:1479-1489.

[27]SANSOM S E，NUOVO G J，MARTIN M M，et al.miR-802 regulates human angiotensinⅡtype 1 receptor expression in intestinal epithelial C2BBe1 cells[J].American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2010，299:G632-G642.

[28]CHASSIN C，KOCUR M，POTT J，et al.miR-146a mediates protective innate immune tolerance in the neonate intestine[J].Cell Host ＆ Microbe，2010，8:358-368.

[29]LU L F，BOLDIN M P，CHAUDHRY A，et al.Function of miR-146a in controlling treg cell-mediated regulation of Th1 responses[J].Cell，2010，142:914-929.

[30]SINGH N，SHIRDEL E A，WALDRON L，et al.The murine caecal microRNA signature depends on the presence of the endogenous microbiota[J].International Journal of Biological Sciences，2012，8:173-186.

[31]LIAO Y，L?NNERDAL B.miR-584 mediates posttranscriptional expression of lactoferrin receptor in Caco-2 cells and in mouse small intestine during the perinatal period[J].The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2010，42:1363-1369.

[32]YU J，LIU F L，YIN P，et al.Integrating miRNA and mRNA expression profiles in response to heat stress-induced injury in rat small intestine[J].Functional ＆ Integrative Genomics，2011，11:203-213.