甲狀腺癌miRNA-146與BRAF突變的相關(guān)性研究

姚廷敬，彭德峰，朱金海，朱正志，周 銳，馬小開(kāi)，崔 振，王巖巖

甲狀腺癌(thyroidcarcinoma)是一種十分常見(jiàn)的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，也是近年世界上發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，在北美與亞太地區(qū)已列入常見(jiàn)腫瘤的前10 位，但其作用機(jī)制仍不明了。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是術(shù)前診斷甲狀腺腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，然而仍有20%～30%不能確定者，目前尚無(wú)理想的腫瘤標(biāo)志物用于甲狀腺癌診斷，因此探討甲狀腺癌的的早期診斷方案就具有重要的臨床意義。miRNA 是上個(gè)世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一種單鏈小分子RNA，在體內(nèi)參與了一系列生理過(guò)程。miRNA-146 是最近發(fā)現(xiàn)的一種免疫調(diào)控因子，在自身免疫疾病進(jìn)展中的作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，有望成為一種診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。此外，ARAF 癌基因是目前研究最多的具有特異性的甲狀腺癌基因，其突變是甲狀腺癌常見(jiàn)的基因突變。本研究對(duì)甲狀腺癌中ARAF 突變與miRNA－146 表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，希望為甲狀腺癌診斷提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年4月～2012年4月我院收治的甲狀腺癌患者30 例作為觀察組，其中乳頭狀癌19 例、濾泡狀癌6、未分化癌5 例，所有患者復(fù)符合甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。將患者術(shù)中切下的腫瘤組織進(jìn)行石蠟固定;選取正常甲狀腺組織28 例作為對(duì)照組，2 組患者在年齡、性別構(gòu)成等資料無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 2 組人群一般資料比較(±s)

表1 2 組人群一般資料比較(±s)

組別例數(shù)性別男女平均年齡(歲)觀察組30171342.37 ±7.63對(duì)照組28161241.72 ±8.59 t 值2.5721.1970.361 P 值＞0.05＞0.05＞0.05

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 分以下幾步進(jìn)行:

1.2.1 免疫組化步驟［2］(1)石蠟切片脫蠟至水;(2)3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;(3)蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 min×3 次;(4)5%～10%正常山羊血清(PBS 稀釋1:400)封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，再滴加AR 鼠單克隆抗體(PBS 稀釋1:400)于切片上，37℃孵育1～2 h 或4℃過(guò)夜;(5)PBS 沖洗，5 min ×3 次;(6)滴加適量生物素標(biāo)記二抗于切片標(biāo)本上，37℃孵育10～30 min;(7)PBS 沖洗，5 min×3 次;(8)滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min;(9)PBS 沖洗，5 min×3 次;(10)將新配制的DAB 液滴加于切片上，顯微鏡下顯色3～15 min;自來(lái)水充分沖洗，蘇木紫復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.2.2 查閱相關(guān)文獻(xiàn)［3-4］設(shè)計(jì)引物，上游引物:5’-CTGGCATGTGAGCGCCTGCT-3’，下游引物:5’-CCACTTGGCTGTCCCGGCTG-3’;根據(jù)BRAF 常見(jiàn)在15 號(hào)外顯子T1799 位置突變，將BRAF 第15 號(hào)外顯子突變頻率最高的序列進(jìn)行擴(kuò)增。用基因組DNA 作為模板，使用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增;PCR 反應(yīng)體系30 μl，其中ddH2O 17 μl，緩沖液10 ×buffer3 μl，dNTP5 μl，Taq 聚合酶0.1 U，DNA 模板0.5 μl，MgCl24.5 μl;擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性10 min，90℃變性1 min，60℃退火1 min，70℃延伸1 min。35 個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳，溴化乙錠染色，PCR 產(chǎn)物割膠回收。

1.2.3 電泳限制性酶切 PCR 產(chǎn)物15 μl，10 × buffer2 μl，NciI 內(nèi)切酶2 μl，雙蒸水6 μl，總反應(yīng)體系25 μl?；靹蚝?8℃過(guò)夜，瓊脂凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.2.4 DNA 測(cè)序 用凝膠與Marker 條帶相近的樣本進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，BRAF 測(cè)序結(jié)果與BRAF 基因組序列對(duì)比，確定是否突變及突變位點(diǎn)。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 每個(gè)切片選取5 個(gè)視野，取均值。按照著色深淺:0 分未著色，1 分著色較淡，2 分著色較深，3 分著色很深;按照著色范圍:0 分陰性，1 分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于20%，2 分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)21%～60%，3 分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)61%～75%，4 分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于75%。采用陽(yáng)性細(xì)胞顯色范圍與染色深淺相乘的方法進(jìn)行評(píng)分，小于等于3 分為免疫反應(yīng)陰性，大于3 分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有研究數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)，P 值采用雙側(cè)檢驗(yàn)。若P＜0.05 則表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA－146 在正常組織和甲狀腺癌組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，30 例甲狀腺癌組織中有27 例(90.0%)出現(xiàn)miRNA-146 表達(dá)陽(yáng)性，而在正常組織中miRNA-146 表達(dá)為陰性，2 組染色評(píng)分均值分別為0.07 和7.34，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 2 組miRNA-146 的表達(dá)(n，%)

2.2 BRAF 基因檢測(cè) 通過(guò)BRAF 基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在30 例甲狀腺癌患者中，有17 例BRAF 基因突變，陽(yáng)性率為51.0%，BRAF 突變?cè)?5 號(hào)外顯子1 799 位點(diǎn)，為點(diǎn)突變，其中腺嘌呤替換為胞嘧啶(T1799A)。

2.3 甲狀腺癌中BRAF 突變與miRNA－146 表達(dá)相關(guān)性 在甲狀腺癌患者中，BRAF 突變陽(yáng)性組miRNA-146 表達(dá)明顯高于陰性組，miRNA-146 表達(dá)陽(yáng)性率分別為94.1%(16/17)和76.9%(10/13)，miRNA-146 表達(dá)評(píng)分均值分別問(wèn)9.51 和4.45，2 組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 甲狀腺癌中BRAF 突變與miRNA－146 表達(dá)關(guān)系(n，%)

3 討論

甲狀腺癌(thyroidcarcinoma)是一種十分常見(jiàn)的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，也是近年世界上發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，在北美與亞太地區(qū)已列入常見(jiàn)腫瘤的前10 位，但其作用機(jī)制仍不明了［5］。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是術(shù)前診斷甲狀腺腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，然而仍有20%～30%不能確定者，目前尚無(wú)理想的腫瘤標(biāo)志物用于甲狀腺癌診斷，因此探討甲狀腺癌的的早期診斷方案就具有重要的臨床意義。

miRNA 是由Lee 等［6］1993年首先發(fā)現(xiàn)并在《Cell》上報(bào)道的一段由18～24 個(gè)核苷酸構(gòu)的非編碼的單鏈小分子RNA，其發(fā)現(xiàn)被美國(guó)《科學(xué)》雜志列為2002年世界十大科技突破之首。miRNA 普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)并參與了生命過(guò)程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及在基因表達(dá)調(diào)控中的作用等。研究證實(shí)［7］，miRNA 在物種間具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA 在基因轉(zhuǎn)錄后水平上，通過(guò)與靶mRNA 互補(bǔ)結(jié)合，對(duì)基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用或基因沉默作用。miRNA 的發(fā)現(xiàn)使生物學(xué)許多領(lǐng)域都煥然一新。目前，已有大量的miRNA 被克隆，新的miRNA 又不斷被發(fā)現(xiàn)。據(jù)推算［8］，人類(lèi)基因組中有約1 000 多個(gè)miRNA 基因，單個(gè)miRNA 可調(diào)節(jié)200 多個(gè)靶基因，約三分之一的蛋白編碼基因受miRNA 的調(diào)控。RNA-146 是最近發(fā)現(xiàn)的一種免疫調(diào)控因子，在自身免疫疾病進(jìn)展中的作用已經(jīng)成為研究人點(diǎn)，有望成為一種診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

臨床上，BRAF 基因突變常用預(yù)測(cè)預(yù)后不佳的基因標(biāo)志物［9］，其與甲狀腺癌的浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著密切聯(lián)系。通過(guò)檢測(cè)BRAF 基因突變可以對(duì)甲狀腺癌活檢進(jìn)行輔助診斷，此外還可以進(jìn)行篩選BRAF 抑制劑來(lái)進(jìn)行靶向治療［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中，miRNA-146 表達(dá)陽(yáng)性率為90.0%，而在正常組織中miRNA-146 表達(dá)為陰性，2 組染色評(píng)分均值分別為0.07 ±0.03 和7.33 ±0.01，這說(shuō)明，miRNA-146是高敏感和特異性強(qiáng)的標(biāo)志物，可以為甲狀腺癌診斷提供依據(jù);對(duì)miRNA-146 與BRAF 基因突變相關(guān)性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，miRNA-146 表達(dá)與BRAF 基因突變密切相關(guān)，我們推測(cè)BRAF突變可能是通過(guò)調(diào)控miRNA-146 進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。

綜上所述，在甲狀腺癌中，miRNA-146 表達(dá)增加，且miRNA-146 表達(dá)與BRAF 基因突變密切相關(guān)。但是由于本研究樣本數(shù)量較少，需要加大樣本數(shù)，對(duì)具體的機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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