紅豆杉多糖的生物活性及其提取純化研究進(jìn)展

(.浙江省立同德醫(yī)院藥劑科，杭州 3002；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，杭州 30007)

·綜 述·

紅豆杉多糖的生物活性及其提取純化研究進(jìn)展

葉佐武1，楊秀麗1，石佳娜1，黃 萍1,2*(1.浙江省立同德醫(yī)院藥劑科，杭州 310012；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，杭州 310007)

目的 介紹紅豆杉多糖的生物活性及其提取純化研究進(jìn)展，為紅豆杉資源的進(jìn)一步利用提供依據(jù)。方法 通過查閱近10年的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)紅豆杉多糖的生物活性及其提取純化進(jìn)行概述。結(jié)果 紅豆杉多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷等作用；紅豆杉多糖提取純化工藝取得一定的進(jìn)展，可采用組織破碎提取法、超聲波提取等方法進(jìn)行提取，并利用樹脂法、雙氧水法等方法進(jìn)行純化。結(jié)論 紅豆杉多糖的研究和開發(fā)利用具有廣闊的前景，但其提取、分離和純化技術(shù)有待進(jìn)一步研究。

紅豆杉多糖；生物活性；純化

多糖是廣泛存在于有機(jī)體內(nèi)的一種重要的信號(hào)或信息分子的受體，它參與分子識(shí)別、細(xì)胞粘附以及機(jī)體防御等過程的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出多樣的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗衰老和保護(hù)肝臟等[1]。

近年來，由于從紅豆杉科紅豆杉屬植物中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇這一著名的抗腫瘤天然產(chǎn)物， 紅豆杉屬植物成為近30年的研究熱點(diǎn)[2-3]。研究者從紅豆杉葉中發(fā)現(xiàn)并分離純化得到一種大分子生物活性物質(zhì)——紅豆杉多糖，實(shí)驗(yàn)明確了該多糖具有抗腫瘤和提高免疫力等方面作用，本文對(duì)紅豆杉多糖的生物活性及其提取純化進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 紅豆杉多糖生物活性研究

1.1 免疫調(diào)節(jié)作用

植物多糖最重要的藥理作用是免疫促進(jìn)功能[4-6]。李循等[7]通過對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化測(cè)定、巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定、T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8和NK細(xì)胞活性測(cè)定等方式，證實(shí)了紅豆杉多糖可以提高荷瘤小鼠的免疫細(xì)胞功能，能夠明顯提高CTX所減低的小鼠T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能和巨噬細(xì)胞吞噬作用，表明了紅豆杉多糖是對(duì)免疫功能有較好的促進(jìn)作用。免疫調(diào)節(jié)作用使紅豆杉多糖表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用，在促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能的非特異性免疫活性的基礎(chǔ)上，使巨噬細(xì)胞處理和傳遞抗原的能力增強(qiáng)，提高了抗體的水平。

1.2 抗腫瘤作用

多糖的抗腫瘤作用主要是提高宿主的免疫功能、改變細(xì)胞膜生化特性和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等因素，同時(shí)多糖類藥物用于抗腫瘤，可以克服化療、放療過程中對(duì)正常細(xì)胞的損傷。

吳綿斌等[8]從南方紅豆杉中提取出多糖組分，進(jìn)行了相關(guān)的結(jié)構(gòu)鑒定，并通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)研究了其抗腫瘤效果，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了紅豆杉多糖對(duì)S180肉瘤、HepA肺癌和Lewis肺癌具有一定的抑制作用，可以提高荷瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率，明顯提高整體動(dòng)物的機(jī)體耐受力以及延長(zhǎng)動(dòng)物常壓缺氧的存活時(shí)間；實(shí)驗(yàn)表明紅豆杉多糖和紫杉醇、巴卡亭等有效組分進(jìn)行合理的配伍，可以大幅度提高紫杉醇的抗腫瘤效果，這為開發(fā)新型的多組分天然紅豆杉抗腫瘤制劑打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

張貴明等[9]在紅豆杉多糖抗腫瘤方面進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，紅豆杉多糖在治療腫瘤時(shí)，不像一般化療藥物直接殺死生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，而是促進(jìn)細(xì)胞體液免疫反應(yīng)，如激活巨噬細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞影響很小。多糖應(yīng)用于治療代謝、感染及癌癥等方面的例子不斷增加。多糖類抗腫瘤藥物，不僅價(jià)格低廉，而且安全無毒，服用方便，需求量和應(yīng)用范圍都將會(huì)超過紫杉醇[10]。

Yuan等[11]在紅豆杉中分離得到兩個(gè)精多糖TMP90W和TMP90S，活性測(cè)試結(jié)果表明，TMP90W對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肺癌細(xì)胞A549均具有一定的抑制作用，且為濃度依賴性。紅豆杉多糖TMP90W作為抗腫瘤或輔助抗腫瘤候選藥物具有很大的潛力。

1.3 對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響

心肌缺血再灌注損傷(myocardium ischemiareperfusion injury，MIRI)導(dǎo)致的心律失常、心肌頓抑等是臨床心臟病患者猝死的常見原因。紅豆杉多糖可以減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷，這將為開發(fā)紅豆杉多糖為主要原料的純天然心臟保護(hù)藥物打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

朱天民等[12]觀察了紅豆杉多糖對(duì)MIRI導(dǎo)致的左室舒張功能及心肌梗死質(zhì)量的影響。首次證實(shí)紅豆杉多糖對(duì)MIRI導(dǎo)致的心肌舒張功能障礙及心肌損傷具有保護(hù)作用。提出了紅豆杉多糖可能通過降低心肌組織NADPH 氧化酶NCF-47K mRNA 表達(dá)，升高SOD 活性，減少O2+等氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[13]。同時(shí)，該課題組通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，明確紅豆杉多糖可抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低心肌組織MCP-1蛋白表達(dá)及NO水平以及抑制Fas mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)[14-15]。

李輝等[16]將比格犬隨機(jī)分組建立MIRI模型，觀察紅豆杉多糖對(duì)犬MIRI模型心肌組織損傷及超微結(jié)構(gòu)變化的影響，光鏡觀察心肌組織損傷病理改變，日立H-600Ⅳ型透射電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。光鏡及透射電鏡均證實(shí)紅豆杉多糖具有減輕MIRI的作用，該作用可能與其保護(hù)線粒體、胞核、肌絲及抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

2 紅豆杉多糖提取純化研究進(jìn)展

2.1 紅豆杉多糖含量研究

南方紅豆杉提取紫杉醇后基本被廢棄，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。南方紅豆杉中富含活性多糖。吳綿斌等[17]采用水提醇沉法從南方紅豆杉枝葉中得到紅豆杉總多糖，經(jīng)DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜分離得到3種酸性多糖，分別命名為紅豆杉多糖-1(PTM-1)、紅豆杉多糖-2(PTM-2)和紅豆杉多糖-3(PTM-3)。早前有研究者探究過紅豆杉種子的成分，其干重種子粗蛋白、粗脂肪、淀粉、可溶性糖的含量分別為9.92%，72.86%，4.15%，0.38%，氨基酸含量為9.10%，種子油脂肪酸組成以不飽和的油酸和亞油酸為主，其相對(duì)含量為48.4% 和42.2%[18]。

金莉莉[19]對(duì)同一批次的延邊紅豆杉樹皮進(jìn)行了多糖含量測(cè)定，觀察多糖提取中SEVAG法、TCA除蛋白質(zhì)的效果，應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量， 測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。測(cè)得樣品中粗多糖的產(chǎn)率為25.9%，2種除蛋白質(zhì)的方法中TCA法可達(dá)到較高的脫蛋白率，精制多糖的含量為76.0%。

江蕾等[20]采用紅外光譜進(jìn)行分析，表明紅豆杉多糖為吡喃型的酸性雜多糖，通過密度梯度超速離心分離發(fā)現(xiàn)它有明顯的4個(gè)條帶，大致認(rèn)為是4個(gè)不同的多糖組分。收集得到組分TM-1。測(cè)得其比旋光度為＋65.3°；經(jīng)HPLC凝膠色譜，顯示它是單一組分，其分子量約為317 000；完全酸水解后HPLC分析表明TM-1主要由D-巖藻糖、D-葡萄糖、鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖和L(+)-阿拉伯糖等七種單糖組成，其中D-木糖最多，占41.47%，D-半乳糖次之，占19.77%。

另有研究報(bào)道[21]，對(duì)紅豆杉枝葉初步處理后，用熱水浸提后，透析純化得到的粗糖，得到T1多糖，分子量在344萬道爾頓，T1多糖包括2,4-二甲基甘露糖、鼠李糖、樹膠醛糖、木糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，它們的比例是2︰5︰24︰9︰3︰46︰1︰10，乙酰基的含量大概在2.1%。

2.2 紅豆杉多糖浸提工藝研究

粗糖提取的方法目前主要是：煎煮法、回流法、浸漬法、蒸餾法、滲漉法、連續(xù)回流法、超臨界萃取技術(shù)、超聲提取技術(shù)、微波萃取技術(shù)、破碎提取法。以上各種傳統(tǒng)的提取方法都有一定的利弊?！敖M織破碎提取法”是劉延澤教授[22]在國(guó)內(nèi)率先提出的用于中草藥化學(xué)成分提取的一種新方法；與傳統(tǒng)方法相比，它具有高效、快速、不需加熱、不破壞成分、適宜多數(shù)溶劑等突出優(yōu)勢(shì)，值得推廣運(yùn)用。

江蕾等[20]的研究指出，將多糖的浸提過程分為三個(gè)階段：起始階段，飽和擴(kuò)散階段，不飽和擴(kuò)散階段。第一和第三階段影響很小，對(duì)第二階段根據(jù)物料衡算建立了動(dòng)力學(xué)模型為：ln[Ck/(Ck-c)]= k1(t-t1)模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合良好。在采用熱水浸提中，對(duì)浸提效果影響大小的順序?yàn)椋毫纤龋窘釡囟龋窘釙r(shí)間。在綜合正交試驗(yàn)以及充分考慮經(jīng)濟(jì)因素的情況下，最終確定了紅豆杉多糖在二次水提法的最佳工藝條件為：料液比1∶25，浸提溫度90℃，浸提時(shí)間150 min，多糖提取率約為11.9%。

張貴明[9]的研究中，嘗試采用超聲波法對(duì)紅豆杉多糖進(jìn)行提取，并對(duì)脫蛋白、脫色多糖純化方法進(jìn)行研究，即傳統(tǒng)的純化方法與現(xiàn)代的樹脂純化方法進(jìn)行比較，優(yōu)選和確定了多糖純化的工藝條件：正交實(shí)驗(yàn)所得最佳組合為超聲提取的最優(yōu)組合，即料液比1∶20，浸提溫度50 ℃，浸提時(shí)間20 min。首次利用超聲提取和樹脂純化對(duì)紅豆杉多糖進(jìn)行富集、純化和分離，避免和解決了傳統(tǒng)制備方法造成的環(huán)境污染和溶劑浪費(fèi)，為制備方法的現(xiàn)代化、產(chǎn)物(品)的標(biāo)準(zhǔn)化提供有利條件。

粗糖脫蛋白有多種方法，比如Sevege法除蛋白，TCA法除蛋白，樹脂法。常用的脫色方法有：離子交換法、氧化法、金屬絡(luò)合物法、吸附法(纖維素、硅藻土、活性碳等)。

大孔吸附樹脂是近年來新發(fā)展起來的一種有機(jī)高分子聚合物吸附劑，其應(yīng)用日趨廣泛，特別是在天然產(chǎn)物的分離純化方面逐漸顯示出其優(yōu)越性[23]。張貴明[9]的研究中，大孔吸附樹脂需先進(jìn)行預(yù)處理，用水除去水溶性雜質(zhì)，用有機(jī)溶劑除去脂溶性雜質(zhì)，再用吸附介質(zhì)除去殘留的其他溶劑。然后用不同型號(hào)的大孔吸附樹脂分別對(duì)紅豆杉多糖進(jìn)行脫蛋白、脫色純化，蛋白脫除率為97.42%，脫色率為58.53%，取得比較滿意的效果。

吳綿斌[17,21]研究報(bào)道，通過對(duì)紅豆杉粗多糖純化工藝的實(shí)驗(yàn)研究，建立了一套完整的純化技術(shù)方案，利用雙氧水進(jìn)行脫色效果可達(dá)60.4%，糖保留率84.7%，比活性炭和樹脂都要好，但同時(shí)由于其具有比較強(qiáng)的氧化性，可能對(duì)多糖結(jié)構(gòu)有一定的影響，有待進(jìn)一步研究。

3 總結(jié)與展望

紅豆杉(Taxusma irei)是古老樹種，不僅是重要的用材樹種及觀賞樹種，更是珍貴的藥用植物[24]。在20世紀(jì)90年代，美國(guó)腫瘤研究所已發(fā)現(xiàn)從紅豆杉根、皮、枝、葉中提取的紫杉醇可治療癌癥、白血病及艾滋病[25]。由美國(guó)施貴寶公司開發(fā)的紫杉醇原料為太平洋紫杉的樹皮，是細(xì)胞抑制劑類抗腫瘤藥物，可干擾癌細(xì)胞的微蛋白合成從而發(fā)揮抑癌作用[26]。目前關(guān)于紅豆杉抗腫瘤的研究主要集中在紫杉烷類化合物，特別是紫杉醇方面。紅豆杉在世界范圍內(nèi)不僅含量少，而且生長(zhǎng)緩慢，而紅豆杉在被提取紫杉醇后基本被廢棄，既浪費(fèi)了資源又污染了環(huán)境。

目前紅豆杉多糖的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值已經(jīng)嶄露頭角，但是由于紅豆杉多糖結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系復(fù)雜，給進(jìn)一步研究帶來困難，隨著分離和分析技術(shù)的改進(jìn)，結(jié)合深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究，相信對(duì)紅豆杉多糖的研究和開發(fā)利用具有廣闊的前景。

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The Development of Biological Activity and Study on Extraction and Purification for Taxus Polysaccharides

YE Zuowu1, YANG Xiuli1, SHI Jiana1, HUANG Ping1,2*(1.Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China; 2.Traditional Chinese Medicine Research Institute of Zhejiang Province, Hangzhou 310007, China)

OBJECTIVE To review the development of study on biological activity, extraction and purification for Taxus polysaccharides. METHODS To summarize the biological activity and the technique of extraction and purification of Taxus polysaccharides by reviewing the domestic and foreign articles in the past ten years. RESULTS There are multiple functions for Taxus polysaccharides such as adjusting immunity, anti tumor, alleviating ischemia reperfusion injury on myocardium, and so on. A certain development has been approached on the technique of extraction and purification for Taxus polysaccharides. The extraction methods of tissue crush and ultrasonic wave are recommended. And purification ways of peucine and hydrogen peroxide are selectable. CONCLUSION There are broad prospects on the study and exploitation of Taxus polysaccharides. The techniques of extraction, separation and purification, however, are worth further research.

Taxus polysaccharides; biological activity; purification

R284.2

A

1007-7693(2013)05-0549-04

2012-12-06

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2110933)

葉佐武，男，主管藥師 Tel: (0571)89972238 E-mail: yezuowu@126.com*

黃萍，女，碩士，主任藥師，碩導(dǎo) Tel: (0571)89972233 E-mail: huangpwly@sina.com