實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型的研究進(jìn)展

張東梅，黃欣，閆春雷，蘇樂群 （．山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南500；．山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南5004）

肝臟疾病是影響人類健康的最為常見的疾病之一，目前對于肝臟疾病的防治仍是一個(gè)嚴(yán)峻的課題，因此肝損傷動物模型的復(fù)制對于肝臟發(fā)病機(jī)制研究及護(hù)肝藥物的篩選具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，肝損傷動物模型的復(fù)制主要有化學(xué)性、免疫性、酒精性、藥物性、生物性等方法，其中生物學(xué)方法要求實(shí)驗(yàn)條件高且費(fèi)用昂貴，多用于病原體及其致病機(jī)制的高層次研究；目前科研中較常用的是化學(xué)性肝損傷、免疫性肝損傷和酒精性肝損傷模型［1］。本文簡要綜述了建立急、慢性肝損傷動物模型的機(jī)制、方法、特點(diǎn)、應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)，以期為肝損傷動物模型的選擇提供參考。

1 化學(xué)性肝損傷

1．1 四氯化碳（CCl4） CCl4是經(jīng)典的復(fù)制肝損傷動物模型的化學(xué)物質(zhì)，其肝損傷的機(jī)制與CCl4經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)生的三氯甲烷自由基引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)有關(guān)。三氯甲烷自由基生成后引起膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與肝細(xì)胞蛋白或DNA結(jié)合破壞肝細(xì)胞機(jī)能，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死。

成年大鼠（Wistar／SD，6～8周齡，雄性多用，下同），一次性腹腔或皮下注射CCl41 mL·kg－1（40%～50%CCl4植物油溶液），24 h左右可形成急性肝損傷模型；采用40%的CCl4植物油溶液按照CCl41 mL·kg－1灌胃或腹腔注射，每周2次，持續(xù)8～12周可形成慢性肝損傷大鼠模型。苯巴比妥、丙酮和酒精等細(xì)胞色素P450同工酶化學(xué)誘導(dǎo)劑可加強(qiáng)CCl4的肝毒性，縮短CCl4慢性肝損傷的造模時(shí)間。

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型不僅在病理生理方面與人類肝臟疾病的改變相類似，而且重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。但該模型屬于中毒性肝損傷范疇，在免疫病理上與多數(shù)肝炎有很大區(qū)別，不適于對有護(hù)肝作用的免疫調(diào)節(jié)劑或影響免疫系統(tǒng)的護(hù)肝藥物評價(jià)。另外，CCl4除損害肝組織外，對其他臟器也有損傷，死亡率高。因CCl4揮發(fā)性較大，對實(shí)驗(yàn)人員也有一定的傷害，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。

1．2D－氨基半乳糖D－氨基半乳糖（D－galactosamine，DGalN）屬于間接肝毒劑，肝損傷機(jī)制與其在肝內(nèi)的代謝及隨后對核苷酸合成的影響有關(guān)，其作用機(jī)制是：氨基半乳糖與肝細(xì)胞內(nèi)尿苷二磷酸（UDP）結(jié)合而形成復(fù)合物，使尿苷三磷酸（UTP）耗竭，肝細(xì)胞中的RNA和蛋白合成受阻，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)蛋白合成減少，使UDPG尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶－焦磷酸化酶活性和數(shù)量均下降，引起糖和磷脂代謝障礙，膜損傷加重，引起肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞外鈣大量內(nèi)流，引起細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)破壞，進(jìn)一步引起代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。另外，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在肝損傷的過程中也發(fā)揮了重要作用［2］。

成年大鼠按600～900 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射給藥，24～48 h后即可制成急性肝損傷模型［3］。劑量超過1 000 mg·kg－1時(shí)，常引起廣泛性肝壞死。

D－GalN所致肝炎的病理生理改變與人類急性病毒性肝炎非常相似，該模型是目前評價(jià)病毒性肝炎治療藥物療效的較好模型，但該模型與CCl4肝損傷同屬于中毒性肝損傷范疇，也不適于對有護(hù)肝作用的免疫調(diào)節(jié)劑或影響免疫系統(tǒng)的護(hù)肝藥物評價(jià)。氨基半乳糖僅對肝臟有影響，不影響其他器官，但是氨基半乳糖較貴，限制了其廣泛應(yīng)用。

1．3 α－萘基異硫氰酸酯（α－naphthyl isothiocyanate，ANIT）

ANIT是一種間接肝毒劑，常用于誘導(dǎo)急性肝內(nèi)膽汁淤積模型。目前認(rèn)為ANIT引起的肝損傷與谷胱甘肽－ANIT結(jié)合物的形成和膽汁排泄有關(guān)。ANIT與谷胱甘肽可逆性結(jié)合，然后通過小管外排途徑運(yùn)輸?shù)侥懼?，使膽汁?nèi)ANIT聚積，損害肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，引起肝內(nèi)膽管增生及小葉間膽管周圍炎癥，從而造成膽管阻塞，導(dǎo)致膽汁酸和其他膽汁成分在肝臟中積累，并最終產(chǎn)生肝膽毒性。長期腹腔注射ANIT導(dǎo)致的肝損傷與線粒體功能障礙有關(guān)。

將ANIT溶解于橄欖油溶液，成年大鼠按60～100 mg·kg－1劑量灌胃給藥，24～48 h即可形成ANIT急性肝損傷動物模型［4］。采用80 mg·kg－1的劑量腹腔注射，每周1次，持續(xù)16周，可形成慢性肝損傷模型。

ANIT急性肝損傷模型病理學(xué)檢查可見以點(diǎn)狀壞死為主的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害，產(chǎn)生膽汁郁積性黃疸，出現(xiàn)高膽紅素血癥和膽汁分泌減少，用于模擬人類藥物性膽汁淤積和肝損傷。該模型復(fù)制簡單易行，重現(xiàn)性好，是篩選保肝利膽藥的理想實(shí)驗(yàn)動物模型。

1．4 二甲基亞硝胺（dimetylnitrosamine，DMN） DMN 是致癌物和誘變劑，具有較強(qiáng)的肝毒性。其肝損傷的機(jī)制是：DMN經(jīng)肝臟CYP2E1代謝活化產(chǎn)生的甲醛和甲醇與核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生烷基化反應(yīng)，造成細(xì)胞內(nèi)大分子損傷，肝細(xì)胞凋亡壞死。肝臟受致病因子侵襲后，基質(zhì)金屬蛋白酶－2（MMP－2）的表達(dá)與活性增高，肝星狀細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖及膠原蛋白沉積，促進(jìn)肝纖維化的形成與發(fā)展。同時(shí)激活的MMP－2促進(jìn)竇內(nèi)皮細(xì)胞形成肝竇毛細(xì)血管化，加重肝損傷［5］。

用0．15 mol·L－1NaCl將 DMN稀釋為1%濃度，采用成年大鼠或Balb／c小鼠，按10 mg·kg－1劑量大鼠腹腔注射，每周3次，持續(xù)3～4周可形成肝纖維化動物模型。

DMN誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷在初期出現(xiàn)膠原蛋白沉積，這是肝纖維化和肝硬化發(fā)病的關(guān)鍵。該模型是研究肝纖維化機(jī)制、篩選治療肝纖維化藥物的良好動物模型。DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成率高，且形成后相對穩(wěn)定，但DMN毒性較大，易揮發(fā)，并且排泄物含有毒物，污染環(huán)境。

1．5 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA） TAA 攝入后，經(jīng)肝臟混合功能氧化酶系統(tǒng)代謝活化為TAA硫氧化物，繼而代謝產(chǎn)生自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），它們與細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，還原型谷胱甘肽減少，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。另外細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣持續(xù)升高。ROS形成增加和鈣穩(wěn)態(tài)的破壞使線粒體內(nèi)膜滲透性增加，膜電位改變，這些變化激活多個(gè)相關(guān)的導(dǎo)致細(xì)胞損傷或增殖的機(jī)制，從而促進(jìn)肝纖維化肝硬化的發(fā)展。

成年大鼠采用400 mg·kg－1的劑量腹腔注射TAA，12～24 h后即造成大鼠急性肝衰竭模型；采用200 mg·kg－1劑量腹腔注射，每周3次，持續(xù)8周可形成典型的肝纖維化模型［6］；采用含 TAA300 mg·L－1（約為25 mg·kg－1·d－1）的飲水喂養(yǎng)3～4個(gè)月可誘導(dǎo)大鼠形成肝硬化模型。

TAA誘發(fā)的肝纖維化與人肝纖維化的生化病理變化相似，并且死亡率低、成功率高，形成的肝纖維化相對穩(wěn)定不易逆轉(zhuǎn)，是經(jīng)典的肝纖維化模型之一，適用于肝纖維化機(jī)制的研究與治療藥物的篩選評價(jià)等。

2 免疫性肝損傷

2．1 刀豆蛋白A（Con A） Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，依賴于CD4＋T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間相互作用，通過淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及肝臟中的Kupffer細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)造成肝損傷。在此過程中細(xì)胞因子TNF－α、IFN－γ、IL－6等在細(xì)胞增殖及凋亡和壞死中起重要作用［7］。

6～8周齡雄性Balb／c小鼠一次性尾靜脈注射ConA15～20 mg·kg－1，12 h可形成急性免疫性肝損傷模型［8］；尾靜脈注射ConA10 mg·kg－1，每周1次，持續(xù)8周，可形成慢性免疫性肝損傷模型［9］。

ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，較好地模擬人類病毒性肝炎引發(fā)的免疫性肝損傷的病理生理過程。ConA所致的肝損傷具有劑量依賴性和器官特異性，制作簡單無需預(yù)先致敏。該模型與人類病毒性肝炎相比，不存在病毒復(fù)制和肝實(shí)質(zhì)持續(xù)損傷的過程，僅有利于從免疫學(xué)角度探討發(fā)病機(jī)制和評價(jià)藥物療效。

2．2 BCG聯(lián)合細(xì)菌脂多糖（LPS） LPS是一種內(nèi)毒素，可誘發(fā)預(yù)先接種卡介苗（BCG）的小鼠形成急性肝損傷模型。BCG聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的肝損傷，其損傷機(jī)制是以細(xì)胞免疫為主的變態(tài)反應(yīng)，BCG首先激活致敏T淋巴細(xì)胞，尤其是致敏肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，當(dāng)注射LPS后進(jìn)一步激活致敏的Kuppfer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其釋放大量的細(xì)胞毒因子，如腫瘤壞死因子、一氧化氮、白細(xì)胞介素、自由基、白三烯等造成肝細(xì)胞損害。

采用6～8周齡雄性昆明小鼠或C57BL／6小鼠，首先尾靜脈注射含5×106－7個(gè)活菌的BCG生理鹽水溶液，致敏T淋巴細(xì)胞。10 d后，尾靜脈注射含7．5～10μg LPS的脂多糖生理鹽水，16 h后形成免疫性肝炎模型［10］。

BCG聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型的病理過程，與人類肝炎中Kupffer細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞在肝細(xì)胞內(nèi)浸潤并釋放大量細(xì)胞因子造成的肝細(xì)胞損害的病理過程相似。該模型為臨床研究病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制以及從免疫途徑篩選護(hù)肝藥物提供了良好的動物模型，并且造模時(shí)間短，方法簡便易行。但該模型制作過程中需用BCG預(yù)先致敏，BCG批號不同，活性可能存在差別，所以實(shí)驗(yàn)前需對BCG用量進(jìn)行摸索調(diào)整。另外也可用滅活的短小棒狀桿菌或痤瘡丙酸桿菌預(yù)先致敏。

2．3D－GalN聯(lián)合LPSD－GalN可耗竭肝細(xì)胞內(nèi) UTP，抑制RNA合成；促使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺，引發(fā)結(jié)腸水腫，增強(qiáng)機(jī)體對LPS的敏感性。LPS活化Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成和分泌TNF－α及其他炎性細(xì)胞因子，使D－GalN致敏小鼠發(fā)生的肝細(xì)胞凋亡和壞死；此外氧自由基產(chǎn)生的氧化應(yīng)激也是一種重要的損傷因素。最近研究表明，在DGalN聯(lián)合LPS介導(dǎo)的急性肝衰竭與JNK的持續(xù)性活化有關(guān)［11］，因?yàn)镴NK的持續(xù)的活化會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

6～8周齡雄性Balb／c小鼠，按D－GalN300～700 mg·kg－1和LPS50～10μg·kg－1的劑量腹腔注射，16 h后可形成小鼠免疫性急性肝損傷模型。

D－GalN聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型被認(rèn)為是內(nèi)毒素引起肝損傷的良好模型，在內(nèi)毒素性肝損傷的損傷機(jī)制研究及相關(guān)藥物的篩選評價(jià)中具有重要意義，但在制作過程中需要預(yù)先致敏。

3 藥物性肝損傷

3．1 對乙酰氨基酚（AP） AP的肝毒性與其在肝內(nèi)的代謝有關(guān)。通常情況下，AP主要在肝內(nèi)與硫酸鹽和葡糖苷酸結(jié)合，只有少量被CYP2E1酶降解為高毒性的活性代謝物N－乙酰－對－苯醌亞胺（NAPQI），NAPQI與線粒體內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）結(jié)合后解毒。當(dāng)AP劑量過大時(shí)（超過12～15 g），其代謝過程中產(chǎn)生的大量NAPQI超過了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQI與細(xì)胞和線粒體蛋白質(zhì)結(jié)合，影響它們的功能并最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

將AP加熱溶于生理鹽水，按300～500 mg·kg－1劑量給6～8周齡雄性Balb／c小鼠一次性腹腔注射，也可用2．5%的AP混懸液灌胃給藥，24 h后可形成急性肝損傷模型。

AP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型出血和脂肪變性不明顯，形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為以中央靜脈為中心的圓盤狀大量細(xì)胞壞死，多用于因各種原因?qū)е鹿入赘孰暮繙p少而引起肝細(xì)胞損傷的治療藥物篩選。AP誘導(dǎo)的肝損傷對小鼠十分敏感而對大鼠不敏感。

3．2 異煙肼聯(lián)合利福平 異煙肼和利福平兩藥聯(lián)用是目前結(jié)核病短程療法的治療方式，但兩藥聯(lián)用肝毒性明顯增加，其機(jī)制是：異煙肼在肝臟中經(jīng)過CYP450代謝為乙酰肼及肼，肼與巰基反應(yīng)導(dǎo)致肝內(nèi)的GSH耗竭而引起細(xì)胞膜及線粒體膜的脂質(zhì)過氧化，線粒體膜通透性改變，肝細(xì)胞損傷。而利福平在肝臟中去乙?；瑸楫悷熾乱阴；峁┮阴；依Ｆ秸T導(dǎo)CYP450酶，使異煙肼代謝加快，乙酰肼代謝的活性中間體及肼的量相繼增加，導(dǎo)致肝毒性明顯增加。

成年大鼠灌胃或腹腔注射異煙肼50～100 mg·（kg·d）－1，利福平50～100 mg·（kg·d）－1，持續(xù)3～4周，可形成大鼠肝損傷模型［12］。

異煙肼聯(lián)合利福平建立的大鼠肝損傷模型，病理學(xué)檢查可見肝細(xì)胞腫脹、淤血，羽毛狀變性，小葉中心區(qū)域出現(xiàn)炎癥［13］。該模型為深入研究人類異煙肼利福平聯(lián)用導(dǎo)致肝損傷的發(fā)病機(jī)制提供較好的動物模型。

4 酒精性肝病

目前酒精對肝損傷的機(jī)制尚未完全闡明，認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和免疫／炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)［14］。首先，乙醇在肝臟中的毒性代謝產(chǎn)物乙醛能誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激，使線粒體和微管系統(tǒng)受損。乙醇經(jīng)過微粒體乙醇氧化系統(tǒng)中CYP 2E1代謝產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致氧化損傷；其次，長期乙醇暴露會損傷線粒體功能，導(dǎo)致生物能量減少，ROS產(chǎn)生增加，GSH減少，線粒體DNA損傷和蛋白質(zhì)合成抑制，線粒體通透性敏感性增加，通過壞死和細(xì)胞凋亡途徑引起肝損傷；另外長期大量飲酒可激活肝臟的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生大量核轉(zhuǎn)錄因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB），NF－κB促進(jìn)活化的肝臟Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)生大量的炎癥因子 TNF－α、IL－1等［15］，從而引起肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥、壞死，同時(shí)刺激肝細(xì)胞增生，抑制膠原酶活性，促進(jìn)肝纖維的形成。

成年大鼠或小鼠以50～60度白酒一次性灌胃或腹腔注射4～6 g·kg－1，4～24 h可形成急性酒精性肝損傷模型［16］。大鼠按照15 mL·kg－1的劑量灌胃50～60度的白酒，每天1次，12周可形成慢性酒精性肝損傷模型。另有一些學(xué)者采用梯度濃度酒精，分次少量灌胃的方法，對制作大鼠慢性酒精性肝損傷模型的方法進(jìn)行了改進(jìn)。

慢性酒精性肝損傷模型病理學(xué)檢查可見肝細(xì)胞脂肪變性，壞死嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤。一些壞死區(qū)可見明顯的纖維細(xì)胞增生，相鄰肝小葉中央靜脈之間或相鄰匯管區(qū)之間出現(xiàn)橋接壞死。該模型與人類酒精性肝病病變相似，穩(wěn)定可靠，對于人類酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制的研究以及保肝藥物的篩選具有重要意義。缺點(diǎn)是造模時(shí)間長，頻繁灌胃較為繁瑣且操作不當(dāng)可造成動物窒息死亡。

5 缺血再灌注損傷（IR）

IR是指缺血器官、組織重新獲得血液供應(yīng)，不僅不能使組織、器官功能恢復(fù)，反而加重了功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞。研究發(fā)現(xiàn)微循環(huán)障礙、氧自由基過多、鈣超載、Kuffer細(xì)胞活化及細(xì)胞凋亡等是引起肝臟缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。首先肝細(xì)胞因缺血、缺氧使ATP生成減少，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞增多，使細(xì)胞膜以及線粒體功能受損。當(dāng)再灌注時(shí)，氧氣增多，生成大量的自由基，而此時(shí)線粒體功能受損，對氧自由基的清除能力不足，導(dǎo)致氧自由基增多，損傷膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞外基質(zhì)，從而進(jìn)一步加重細(xì)胞的凋亡。另外多種細(xì)胞因子和促炎性因子也參與了肝臟缺血再灌注損傷的病理生理過程。

肝臟缺血再灌注損傷是影響移植肝存活率的一個(gè)重要因素。該模型可用于再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制研究，缺血后處理以及藥物后處理的研究探索，對于減輕及預(yù)防缺血再灌注損傷和改善預(yù)后，具有十分重要的意義。

綜上所述，目前肝損傷模型的造模方法很多，根據(jù)研究目的，選擇特定有針對性的肝損傷動物模型非常必要，但由于影響肝功能的因素多，且造成肝損傷的機(jī)制復(fù)雜，無論哪種實(shí)驗(yàn)性模型都存在缺陷，都不能全面、準(zhǔn)確地反映人類特定肝損傷的本質(zhì)。相信隨著對肝臟疾病研究的深入，相應(yīng)的肝損傷動物模型將不斷地完善；同時(shí)，肝損傷動物模型的完善也將推動著肝臟疾病研究的向前發(fā)展。

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