青蒿素紫外光譜行為及測定方法研究

韓志慧

（天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300192）

青蒿（Artemisia annua L.）又稱黃花蒿，為常用的中草藥之一。青蒿素（artemisinin，QHS）是中國科學(xué)工作者從青蒿中提取、分離、鑒定的一種新型抗瘧藥，因其結(jié)構(gòu)特殊，療效高而毒性很低，引起國內(nèi)外的重視［1，2］。尤其是近年來，青蒿素的國際市場行情很好，中國國內(nèi)已有多家企業(yè)從事青蒿素的生產(chǎn)。青蒿廣泛分布于中國南北各地，資源十分豐富。由于青蒿品種、種植條件、種植技術(shù)等的差異，從而導(dǎo)致青蒿中青蒿含量的不同［3］。

目前已有報道青蒿素的測定方法主要有反相高效液相色 譜法（RP－HPLC 法［4－6］、薄 層 色 譜 法［7］、紅 外 光 譜 法［8］等。由于青蒿素僅在紫外區(qū)203nm 處有較弱的末端吸收，但與堿（0.2% NaOH）反應(yīng)后，產(chǎn)生一化合物（α，β－不飽和酮酸鹽，Q292），該物質(zhì)在292nm 處有最大吸收，可用于紫外分光光度法測定?；衔铮≦292）在pH 5.58～6.04 條件下，又可定量地轉(zhuǎn)化為化合物Q260，該物質(zhì)在260nm 處有最大吸收，可用于高效液相法定量測定青蒿素含量。目前研究［9］報道應(yīng)用較多的是RP－HPLC法。

但對于青蒿素生產(chǎn)企業(yè)而言，在青蒿的收購時期，需要對大量的原料樣品進(jìn)行檢測。由于液相檢測每檢測一個樣品，包括前期準(zhǔn)備時間，通常需要5～10 min，因此需要多臺液相色譜同時工作，這務(wù)必需要增加檢測成本。本試驗利用青蒿素與堿反應(yīng)后產(chǎn)生的化合物（Q292）在292nm 處有最大吸收的特點，建立一個快速、準(zhǔn)確的低成本的青蒿素紫外分光光度法。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及儀器

青蒿：天津藥材公司；

青蒿浸膏：青蒿素含量9.0%（RP－HPLC 法測定），本實驗室自制；

青蒿素對照品：99.9%，美國Sigma公司；

石油醚（30～60℃）、95%乙醇、NaOH 等：均為分析純，天津科威試劑公司；

紫外可見分光光度計：UV－1750，日本島津公司；

電子天平：AUW120D，長沙湘儀公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取方法 參考文獻(xiàn)［10］，略有改動，將經(jīng)過篩選的青蒿葉置于烘箱中40℃烘烤3h后取出，用瓷乳缽研磨至粉狀，過篩60目，制成青蒿葉粉，儲于干燥器中備用。準(zhǔn)確稱取青蒿樣品1g置紙筒中，置于索氏提取器中，加入石油醚浸泡，提取溫度50 ℃，提取至溶劑無色，提取時間2h。濃縮去石油醚，得青蒿浸膏。

1.2.2 浸膏的處理 取青蒿浸膏58 mg，加入50 mL 石油醚溶解后，置分液漏斗中，再加入50 mL 2% NaOH 溶液振蕩靜置分層，棄去下層堿液后，加入50 mL 蒸餾水洗去堿溶性部分至中性。經(jīng)水洗后的提取液置于圓底燒瓶中55 ℃減壓濃縮，得到含青蒿素的浸膏，再以95%乙醇溶解浸膏，并定容于50mL容量瓶，得樣品原液（A）。

另取青蒿浸膏58mg，加入95%乙醇溶解浸膏，并定容于50mL容量瓶，得樣品原液（B）。

1.2.3 青蒿素紫外光譜行為測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精確稱取80 ℃干燥至恒重的青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg置50 mL 容量瓶中，用95%乙醇溶解稀釋至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)溶液C。

（1）青蒿素紫外光譜行為的考察：吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液C 8mL于50mL容量瓶中，以95%乙醇補充至10 mL，補加0.2%NaOH 溶液至刻度，置（50±1）℃水浴中反應(yīng)30 min，流水冷卻至室溫，得標(biāo)準(zhǔn)溶液C1。

另吸標(biāo)準(zhǔn)溶液C 8mL于50mL容量瓶中，以95%乙醇補充至10mL，補加蒸餾水至刻度，置（50±1）℃水浴中反應(yīng)30min，流水冷卻至室溫，得標(biāo)準(zhǔn)溶液C2。分別考察標(biāo)準(zhǔn)溶液C1和C2的紫外光譜行為。

（2）青蒿素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液C 0，2，4，6，8，10 mL 于50 mL 容 量 瓶 中，以95%乙 醇 補 充 至10mL，補加0.2% NaOH 溶液至刻度，置（50±1）℃水浴中反應(yīng)30 min，流水冷卻至室溫。以空白為對照，并測定292nm 處的吸光值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 待測溶液的制備與測定

（1）樣品溶液A1：吸取樣品原液A 5mL于50mL容量瓶中，補充95%乙醇至10mL后，加入0.2% NaOH 溶液至刻度。50 ℃水浴中反應(yīng)30 min后取出，流水冷卻至室溫。以空白為對照，考察溶液的紫外光譜行為，記錄292nm 處的吸光值。

（2）樣品溶液A2：吸取樣品原液A 5mL于50mL容量瓶中，補充95%乙醇至10mL后，加入水至刻度。50℃水浴中反應(yīng)30min后取出，流水冷卻至室溫。以空白為對照，考察溶液的紫外光譜行為，記錄292nm 處的吸光值。

（3）樣品溶液B1：吸取樣品原液B 5mL 于50mL 容量瓶中，補充95%乙醇至10mL后，加入0.2% NaOH 溶液至刻度。50 ℃水浴中反應(yīng)30 min后取出，流水冷卻至室溫。以空白為對照，考察溶液的紫外光譜行為。

（4）樣品溶液B2：吸取樣品原液B 5mL 于50mL 容量瓶中，補充95%乙醇至10mL后，加入水至刻度。50℃水浴中反應(yīng)30min后取出，流水冷卻至室溫。以空白為對照，考察溶液的紫外光譜行為。

浸膏中青蒿素含量按式（1）計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿素對照品的紫外光譜行為

標(biāo)準(zhǔn)溶液C1和C2紫外光譜行為見圖1和圖2。由圖1和圖2可知，青蒿素經(jīng)0.2% NaOH 溶液處理前后標(biāo)準(zhǔn)溶液C1和C2的紫外光譜行為不同。圖2 的最大吸收波長為292nm，圖1為212nm。這是由于50 ℃時青蒿素在0.2%NaOH 溶液中，定量生成α，β－不飽和酮酸鹽，得到一吸收峰在292nm 處的化合物。青蒿素對照品不經(jīng)0.2% NaOH 溶液于50 ℃處理，溶液在292nm 處吸收很小。

2.2 青蒿樣品液A 的紫外光譜行為

圖1 青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液C1 的紫外光譜Figure 1 Artemisinin standard solution C1 UV spectral behavior

圖2 青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液C2 的紫外光譜Figure 2 Artemisinin standard solution C2 UV spectral behavior

圖3 青蒿素樣品溶液A1 的紫外光譜Figure 3 Artemisinin sample solution A1 UV spectral behavior

圖4 青蒿素樣品溶液A2 的紫外光譜Figure 4 Artemisinin sample solution A2 UV spectral behavior

圖3青蒿素樣品溶液A1和A2紫外光譜掃描結(jié)果見圖3和圖4。由圖3和圖4可知，樣品溶液A1在292nm 處有較強的吸收，其吸收光譜同青蒿素對照品在260～290nm 處基本相似，在292nm 處的吸光值為0.766；樣品溶液A2在292nm 處的吸收較弱，吸光值為0.122。這一結(jié)果表明樣品溶液A1有α，β－不飽和酮酸鹽存在；而樣品溶液A2由于沒有添加0.2% NaOH，沒有α，β－不飽和酮酸鹽生成，因此其在292nm 處的吸收不是來源于青蒿素，而是來源于樣品原液中的其它非青蒿素類物質(zhì)的吸收，屬于背景吸收，在進(jìn)行樣品的定量測定時應(yīng)將此部分吸光值減去。

2.3 青蒿樣品原液B的脫蠟處理對紫外光譜影響

青蒿素樣品溶液B1和B2紫外光譜掃描結(jié)果見圖5和圖6。由圖5和圖6可知，樣品溶液B1和B2在292nm 的吸光值要大于相應(yīng)的溶液A1和A2的吸光值。這一結(jié)果表明，青蒿浸膏中蠟質(zhì)物質(zhì)對青蒿素的吸收有影響。如果青蒿浸膏不經(jīng)2% NaOH 溶液的脫蠟處理，青蒿浸膏在292nm下吸光值將升高，從而造成青蒿素含量測定結(jié)果偏高。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察

青蒿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。對圖7標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，回歸方程：

式中：

圖5 青蒿素樣品溶液B1 的紫外光譜Figure 5 Artemisinin sample solution B1 UV spectral behavior

圖6 青蒿素樣品溶液B2 的紫外光譜Figure 6 Artemisinin sample solution B2 UV spectral behavior

圖7 青蒿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 7 The standard curve of Artemisinin

x—— 青蒿素含量，mg；

y——292nm 處的吸光值（OD）。

回歸結(jié)果表明青蒿素在292nm 的吸光值與青蒿素含量0.2～1.0mg／mL范圍下呈線性相關(guān)。

2.5 自制青蒿浸膏中青蒿素含量的測定

經(jīng)吸光度測定樣品A1中ODA1＝0.766，樣 品A2中ODA2＝0.122，ΔOD ＝ODA1－ODA2＝0.644。將ΔOD 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，可推得樣品溶液A1中青蒿素含量為0.539 mg。進(jìn)一步可推得自制浸膏中青蒿素含量為9.29%。該測定結(jié)果同RP－HPLC 測定數(shù)據(jù)9.0%基本一致。如果直接將樣品A1的ODA1＝0.766代入回歸方程，計算得出浸膏中青蒿素含量為11.2%，這一數(shù)值將比實值高出24.4%，使測定結(jié)果偏高。

3 結(jié)論

青蒿浸膏經(jīng)2% NaOH 溶液脫蠟處理后，可有效消除青蒿原料中蠟質(zhì)對青蒿素在292nm 下吸光值的影響。針對青蒿素α，β－不飽和酮酸鹽在292nm 下具有特征吸收，建立了青蒿素含量測定的紫外分光光度法。HPLC 法和紫外分光光度法檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用食品和藥品的檢測工作［11，12］。HPLC法每檢測一個樣品需要5～10 min；而紫外分光光度法上機測定一個試樣只需30s～1 min。另外，購置一臺液相色譜儀需要數(shù)十萬元的資金，而購置一臺紫外分光光度計只需一萬元左右的資金。因此，應(yīng)用紫外分光光度法可太大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，降低檢測費用。因此，紫外分光光度法相對于RP－HPLC法而言，具有投資少，檢測量大，檢測速度快的特點，該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于青蒿素加工生產(chǎn)企業(yè)的原料收購中。

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