羅田金銀花葉中綠原酸的提取工藝改進(jìn)

向 福 劉 亮 秦 婷 曹 禺 方元平 項(xiàng) 俊

（1．經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃州 438000；

2．黃岡師范學(xué)院，湖北 黃州 438000）

金銀花為忍冬科植物的花蕾及初開的花，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤，及解熱抗炎、利膽保肝、降脂、止血、抗?jié)兊人幚碜饔茫?］，可廣泛用于醫(yī)藥、食品和保健等領(lǐng)域。綠原酸是金銀花的主要活性成分，高純度綠原酸價(jià)格昂貴，被稱為“植物黃金”［2］。湖北羅田縣特產(chǎn)羅田金銀花為盤葉忍冬（Lonicera tragophylla Hemsl），香氣濃郁，綠原酸等有效成分高，2011年獲中國地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。

長期以來，金銀花葉一直被視為非藥用部位而未能得到合理開發(fā)和利用，造成了資源極大的浪費(fèi)。事實(shí)上，十多年前人們就發(fā)現(xiàn)山東、河南等地金銀花葉中的綠原酸含量幾乎超過了同一時(shí)期的金銀花［2，3］。后來還發(fā)現(xiàn)金銀花葉和金銀花在臨床上均有清熱解毒之功效，金銀花的莖葉，尤其是葉的有效成分的藥理作用不亞于金銀花［4］。筆者［5］前期發(fā)現(xiàn)羅田金銀花葉中的綠原酸含量高達(dá)7%左右，超過同一時(shí)期花中含量的一倍多。另一方面，金銀花葉藥源遠(yuǎn)比金銀花豐富。有研究［6］表明，金銀花葉的產(chǎn)量大約是同期花產(chǎn)量的10倍，且采集容易，價(jià)格便宜。當(dāng)前金銀花價(jià)格逐年看漲，采用金銀花葉提取綠原酸，不僅能降低生產(chǎn)原料成本，還能科學(xué)合理利用金銀花資源。因此，研究羅田金銀花葉中綠原酸的提取工藝，可為地方金銀花資源高附加值產(chǎn)品的精深加工提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，對(duì)促進(jìn)大別山地區(qū)金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

綠原酸提取的傳統(tǒng)工藝為醇提法和水提法：醇提法雖然綠原酸的產(chǎn)率高、提取雜質(zhì)少，但有機(jī)溶劑消耗量大；水提法雖無需消耗有機(jī)溶劑，但多糖等水溶性雜質(zhì)多、綠原酸的產(chǎn)率低［7］。Zhao等［8］研究表明，多孔介質(zhì)孔內(nèi)液體沸騰時(shí)會(huì)產(chǎn)生對(duì)流。植物內(nèi)為多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)溶液沸騰所產(chǎn)生的對(duì)流則帶動(dòng)孔內(nèi)的質(zhì)量傳遞。韋藤幼等［9］研究發(fā)現(xiàn)，乙醇溶液浸入植物內(nèi)部溶解的有效成分濃度較高，孔內(nèi)沸騰時(shí)隨對(duì)流從植物內(nèi)部快速擴(kuò)散到植物外部，提取速度發(fā)生突變，提取過程得到強(qiáng)化?？紤]到綠原酸一方面對(duì)熱敏感，穩(wěn)定性較差，不宜進(jìn)行長時(shí)間高溫提取；另一方面又易溶于乙醇，且不同濃度的乙醇溶液透過細(xì)胞壁和解吸綠原酸的能力不同，本試驗(yàn)在傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上提出一種改進(jìn)工藝，即先用少量乙醇溶液浸析金銀花葉，將綠原酸從細(xì)胞組織中溶解，然后加入沸水使金銀花葉孔內(nèi)的乙醇溶液迅速沸騰而強(qiáng)化提取效果，從而大大縮短提取時(shí)間和減少乙醇溶液消耗，節(jié)約生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

羅田金銀花葉：湖北楚天舒藥業(yè)有限公司，陰干，粉碎備用（80目）；

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)20120117，上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

紫外 可 見 分 光 光 度 計(jì)：Varian Cary 100Scan 型，美 國Varian公司；

電子 天 平：Ax－205 METTLER TOLEDO 型，瑞 士 梅 特勒－托利多集團(tuán)；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－S2AA 型，上海亞榮生化儀器廠。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 水提法 將金銀花葉粉碎，稱取10．00g粉末并加入蒸餾水，固液比為1∶20（m∶V），80 ℃回流45 min，共提3次，冷卻至室溫過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在70 ℃條件下濃縮至50mL左右，得綠原酸提取液。

1．2．2 醇提法 將金銀花葉粉碎，稱取10．00g粉末并加入120mL 70%乙醇溶液，于80 ℃下回流60min，冷卻至室溫，過濾，重復(fù)3次，濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在70 ℃條件下濃縮至50mL左右，得綠原酸提取液。

1．2．3 改進(jìn)工藝 將金銀花葉粉碎，稱取10．00g粉末并加入一定體積及濃度的乙醇溶液，常溫下浸析過夜，再加入一定體積和pH 的沸騰蒸餾水，在沸水水浴中攪拌提取一定時(shí)間，提取3次，冷卻至室溫過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在70 ℃條件下濃縮至50mL左右，得綠原酸提取液。

為探討改進(jìn)工藝的最佳操作條件，針對(duì)關(guān)鍵因子設(shè)計(jì)了單因素試驗(yàn)，各因素水平梯度：乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%，60%，65%，75%，80%；乙醇浸析料液比1∶3，1∶3．5，1∶4，1∶4．5，1∶5（m ∶V）；沸水料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）；pH 值2，3，4，5，6；水浴攪拌時(shí)間10，20，30min。

1．3 綠原酸含量測定

1．3．1 最大波峰掃描 精密稱定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用蒸餾水混勻定容到10mL 即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用紫外可見分光光度計(jì)掃描綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，確定檢測波長為323nm。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 精密吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液5，10，15，20，25，30，35，40，45，50μg／mL，測定吸光度，回歸處理結(jié)果表明，綠原酸在5 ～50μg／mL 濃度范圍與吸光度呈良好線性關(guān) 系，回 歸 方 程 為Y ＝0．043 5 X ＋0．021 7，R2＝0．999 4。

1．3．3 綠原酸含量測定 用紫外可見分光光度計(jì)于323nm 處測定綠原酸提取液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液擬合的回歸方程計(jì)算綠原酸含量。

2 結(jié)果與討論

2．1 乙醇濃度的影響

圖1是羅田金銀花葉粉末在35 mL 乙醇溶液浸析過夜后，用200mL pH 為4的沸水水浴攪拌提取10min條件下，不同乙醇濃度提取綠原酸的結(jié)果。

圖1 乙醇濃度對(duì)綠原酸提取濃度的影響Figure1 Effects of alcohol concentration on extraction

由圖1可知，在乙醇濃度60%時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值，綠原酸提取濃度達(dá)到最佳。隨著乙醇濃度的增加，綠原酸的提取濃度持續(xù)下降，在80%乙醇濃度時(shí)略有回升。乙醇溶液浸析金銀花葉的過程相當(dāng)于綠原酸在細(xì)胞中的解析過程，不同濃度的乙醇溶液解析細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的能力不同。圖1結(jié)果表明60%乙醇溶液解析效果最好，提取的綠原酸濃度高。

2．2 乙醇用量的影響

金銀花葉粉末在60%乙醇浸析過夜后，用200 mL pH為4的沸水水浴攪拌提取10 min條件下，不同乙醇用量對(duì)綠原酸提取效果的影響見圖2。

圖2 乙醇用量對(duì)綠原酸提取濃度的影響Figure2 Effects of alcohol volume on extraction

由圖2可知，隨著乙醇浸析料液比的增加，提取的綠原酸濃度迅速達(dá)到最大值。當(dāng)乙醇的浸析物料比較低時(shí)，乙醇用量少，細(xì)胞中的綠原酸不能充分解析，所提取綠原酸的濃度低，吸光度值小。但當(dāng)乙醇的物料比達(dá)到1∶3．5（m∶V）后（即35mL），綠原酸已充分解吸，再增加乙醇的浸析物料比，綠原酸的濃度無明顯變化。因此，試驗(yàn)中確定乙醇溶液最適用量為35mL。

2．3 沸水用量的影響

金銀花葉在35mL 60%乙醇溶液浸析后，在pH 4條件下用不同物料比的沸水水浴攪拌提取10min，結(jié)果見圖3。

圖3 沸水用量對(duì)綠原酸提取濃度的影響Figure3 Effects of boiling water volume on extraction

由圖3可知，當(dāng)沸水用量達(dá)到200 mL 時(shí)綠原酸的濃度已經(jīng)增加緩慢，即料液比為1∶20（m∶V）的沸水用量即可獲得較好的提取效果。沸水用量少，不足以充分提取綠原酸，但沸水用量太大反而會(huì)增加多糖等水溶性雜質(zhì)的溶出。

2．4 pH 的影響

金銀花葉在35mL 60%乙醇溶液浸析后，在不同pH 條件下用200mL沸水水浴攪拌提取10min，結(jié)果見圖4。

圖4 pH 對(duì)綠原酸提取濃度的影響Figure4 Effects of pH on extraction

由圖4可知，綠原酸的濃度在pH 4達(dá)到峰值，隨著pH值的增加，綠原酸濃度變化趨于平緩。該結(jié)果表明，酸性有利于綠原酸的提取，pH 為4時(shí)羅田金銀花葉中的綠原酸提取效果較好。

2．5 水浴攪拌時(shí)間的影響

金銀花葉在35 mL 60%乙醇溶液浸析后，用200 mL pH 為4的沸水水浴攪拌提取不同時(shí)間，結(jié)果見圖5。由圖5可知，水浴攪拌時(shí)間為10min時(shí)的提取效果最好，隨著時(shí)間的增加，綠原酸的濃度有所下降。金銀花葉中綠原酸的提取過程實(shí)質(zhì)是固相傳遞至液相的傳質(zhì)過程，也就是綠原酸從高濃度區(qū)向低濃度區(qū)的滲透過程。攪拌提取初期金銀花葉與溶劑中的綠原酸在單位時(shí)間內(nèi)具有較高的濃度差，浸出較快，但金銀花葉處于長時(shí)間高溫浸提，會(huì)導(dǎo)致表面產(chǎn)生過熟化和結(jié)膜以及物料內(nèi)膠質(zhì)等過度糊化［10］，阻礙綠原酸浸出。

圖5 水浴攪拌時(shí)間對(duì)綠原酸提取濃度的影響Figure5 Effects of stirring time on extraction

綠原酸為熱敏性物質(zhì)，熱穩(wěn)定性較差，較高溫度下進(jìn)行長時(shí)間提取易分解，這是導(dǎo)致高溫提取10 min后綠原酸濃度下降的主要原因之一。另外，隨著提取時(shí)間的延長，提取物中的多糖等雜質(zhì)會(huì)大量增加，必然導(dǎo)致提取物中綠原酸含量的降低。因此，沸水浴中攪拌提取綠原酸的最佳時(shí)間為10min。

2．6 改進(jìn)工藝的優(yōu)勢

根據(jù)以上單因素分析，確定改進(jìn)工藝的最佳操作參數(shù)為浸析乙醇濃度60%，浸析物料比1∶3．5（m∶V），沸水物料比1∶20（m∶V），pH 為4，沸水水浴攪拌10min，該條件下提取羅田金銀花葉中綠原酸較傳統(tǒng)水提法和醇提法在提取時(shí)間和乙醇用量兩方面都有明顯優(yōu)勢（見表1）。改進(jìn)工藝中由于金銀花葉經(jīng)過乙醇溶液浸析，將綠原酸從細(xì)胞組織中溶解，在沸水作用下乙醇溶液在金銀花葉微孔內(nèi)沸騰，強(qiáng)化了綠原酸的提取速度，提取時(shí)間比傳統(tǒng)水提法減少3．5倍，只有醇提法的1／6。就乙醇用量而言，傳統(tǒng)水提過程無乙醇消耗，醇提法乙醇消耗量大，而改進(jìn)工藝的乙醇消耗量相對(duì)較小，約為醇提法的8．3%左右（按無水乙醇計(jì)）。

表1 不同提取方法比較Table1 Results from different extraction methods

針對(duì)金銀花葉中綠原酸的產(chǎn)業(yè)化分離，筆者課題組利用D101大孔樹脂建立了經(jīng)濟(jì)可行的生產(chǎn)工藝［11］。

3 結(jié)論

（1）與傳統(tǒng)提取法相比，用乙醇溶液浸析、內(nèi)部沸騰的改進(jìn)工藝能強(qiáng)化羅田金銀花葉中綠原酸的提取過程，具有提取時(shí)間短、乙醇用量少等特點(diǎn)，簡單易行，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度60%，浸析乙醇物料比1∶3．5（m∶V），pH 4，沸水物料比1∶20（m∶V），水浴攪拌10min。

（2）本試驗(yàn)將羅田金銀花葉進(jìn)行利用，增加了金銀花資源的精深加工力度，擴(kuò)展了金銀花資源的綜合利用范圍，可促進(jìn)大別山地區(qū)或其他金銀花產(chǎn)地金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

（3）用響應(yīng)面分析優(yōu)化最佳提取工藝以及乙醇溶液在金銀花葉中內(nèi)部沸騰的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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