全脂乳粉需氧芽孢總數(shù)檢驗中不確定度的評定

楊 滔

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

芽孢桿菌（Spore－forming Bacillus）能夠在特定環(huán)境條件下由其細胞質(zhì)高度濃縮脫水而形成一種可以抵抗外界不利因素的特殊休眠體——芽孢（spore），根據(jù)其對氣體的需求類型可以分為需氧型和兼性厭氧型兩大類，根據(jù)其形態(tài)又可分為桿菌和梭菌。對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)物質(zhì)有很強抗性的芽孢可耐受各種不良環(huán)境，如可以在pH 為2．0～3．0的環(huán)境中生存，可以在溫度高達80 ℃甚至以上的條件下生長，南極寒冷的冰雪中也能見到他們的蹤跡［1］。因此芽孢桿菌對外界有害因子抵抗力較強，廣泛分布于土壤、水體、大氣以及動物胃腸道等，即使經(jīng)過殺菌處理后的乳粉，仍有可能殘存一定量需氧型芽孢桿菌。在乳中，這些芽孢桿菌都會不同程度的引起乳及乳制品的變質(zhì)，可以使鮮乳、酸奶中的蛋白質(zhì)、脂肪分解，相應(yīng)的會有蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的腐敗味、脂肪分解產(chǎn)生的酸敗味，并導(dǎo)致原料乳產(chǎn)氣、產(chǎn)酸而變粘稠［2］。因此，芽孢數(shù)和耐熱芽孢數(shù)的多少決定企業(yè)制定的產(chǎn)品質(zhì)量可接受水平（AQL）［3］，可以作為乳粉產(chǎn)品質(zhì)量控制的一個必要的檢測指標(biāo)。

測量不確定度的評定是實驗室質(zhì)量管理體系的重要組成部分和實驗室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容，測量結(jié)果都具有不確定度，當(dāng)測量結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)值附近，客戶索要不確定度時，實驗室應(yīng)在出具檢查報告中給出不確定度［4］。微生物檢測具有非嚴(yán)格性、非度量學(xué)和非統(tǒng)計學(xué)等有別于一般定量檢測的特點，因此本試驗單獨采用重復(fù)性和再現(xiàn)性數(shù)據(jù)來評定不確定度，但也考慮到了偏離。此外，試樣中的微生物一般以單個菌體或菌團的形式存在，其定量檢驗易受到培養(yǎng)基質(zhì)量、操作環(huán)境、稀釋溶液、培養(yǎng)溫度、觀察結(jié)果時間和操作人員技能等因素的影響，使試驗檢測的結(jié)果離散度大，因此采用測試結(jié)果取對數(shù)的形式用于不確定度的評定。通過本試驗的探索和研究一方面可為包括芽孢計數(shù)在內(nèi)的實驗室微生物定量檢測的準(zhǔn)確度和精密度驗證提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)，另一方面也可為乳制品中芽孢桿菌污染的監(jiān)控及其可能造成品質(zhì)問題的預(yù)警機制形成一定的理論基礎(chǔ)，為建立和完善乳制品生產(chǎn)中的全過程控制技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料與設(shè)備

1．1．1 樣品

全脂乳粉：市售。

1．1．2 培養(yǎng)基

乳平板計數(shù)瓊脂（MPC）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1．1．3 主要儀器設(shè)備

多功能熱風(fēng)循環(huán)烘箱：FED 240型，德國Binder公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX－250B－Z型，上海博迅實業(yè)有限公司；

生物安全柜：SG603A－HE型，美國Baker公司；

全自動高壓蒸汽滅菌器：HV－85型，日本Hirayama公司；

電冰箱：BCD－170型，河南新飛電器有限公司；

生物顯微鏡：ECLIPSE 80i型，日本Nikon公司；

拍擊式均質(zhì)器：Basic型，西班牙IUL公司。

1．2 方法

1．2．1 檢驗方法 依據(jù)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定（NY／T 1331－2007）》第二部分進行檢驗，流程如圖1所示。

圖1 測定流程Figure1 Protocol of test

1．2．2 數(shù)學(xué)模型 設(shè)需氧芽孢總數(shù)為A，試驗結(jié)果為X，則：A ＝X CFU／g，最佳

1．2．3 不確定度來源及分析 本試驗的不確定度主要來源于取樣、重復(fù)性、培養(yǎng)條件、加熱條件、樣品保存條件，詳細描述見圖2［7，8］。

2 結(jié)果與分析

2．1 微生物檢測不確定度分析的特點

相對于化學(xué)物質(zhì)、物理量值等其他類型的定量分析，微生物檢測中由天平最大容許誤差、稀釋和取樣過程等因素引入的不確定度都為對合成不確定度貢獻較小的B 類不確定度，可以忽略不計，因此A 類不確定度是需氧芽孢總數(shù)測定中主要引起的不確定。

圖2 不確定度的分量構(gòu)成Figure2 Components of uncertainty analysis

2．2 重復(fù)測量結(jié)果的不確定度評定

對20份試樣進行重復(fù)檢測，由于微生物定量測試的數(shù)據(jù)發(fā)散性較大，直接采用貝塞爾公式計算將得到較大的合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，并且在出現(xiàn)較小樣本均值的情況下其不確定度反而會較大，因此在這種情況需要對試驗結(jié)果進行取對數(shù)的處理方式，再求得該樣本檢測結(jié)果對數(shù)值的均值和殘差平方和。表1即是測試的原始數(shù)據(jù)及其取對數(shù)后求得的均值和殘差平方和列表。

表1 檢驗結(jié)果及分析Table1 Results and analysis

檢測結(jié)果對數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差的合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差可以通過貝塞爾公式求得：

擴展不確定度：U ＝KUc

取值水平P＝95%，v ＝20，查t分布表得：

2．3 報告結(jié)果

本試驗的檢測結(jié)果可以采用平行樣對數(shù)值的平均值或其反對數(shù)值即平行樣平均值兩種方式表達，前者取值區(qū)間在lgX±0．121 8之間，后者則為相對于對數(shù)值再取反對數(shù)得其取值區(qū)間分布。以1號試樣為例，其lgX ＝2．241，則其取值區(qū)間為［2．119，2．363］，取反對數(shù)得兩次測量平均值的取值區(qū)間為［132，231］CFU／g，那么根據(jù)本次測試方法所得的不確定度，第1次測試樣品需氧芽孢總數(shù)的測試結(jié)果可估算區(qū)間為［140，240］CFU／g。

3 討論

全脂奶粉需氧芽孢總數(shù)檢驗中涉及到的重復(fù)性、培養(yǎng)條件、取樣等因素為對合成不確定度貢獻較小的B類不確定度可以忽略不計，以重復(fù)測量帶來的不確定度為主，因此根據(jù)這一情況，本試驗采用統(tǒng)計學(xué)的方法（A 類）來評定測量的不確定度。

由于芽孢總數(shù)檢測數(shù)據(jù)發(fā)散性較大，直接采用貝塞爾公式計算將得到較大的合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，并且在出現(xiàn)較小樣本均值的情況下其不確定度反而會較大，因此應(yīng)首先通過取對數(shù)的方式對本試驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行必要的處理之后，其測量不確定度再采用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差的方法求得。這種處理方式使用便捷，對于每一個獨立的測試對象均適用。此外，即使伴隨著樣本量的擴大，試驗數(shù)據(jù)的增加，依然可以在任何時候加入到合并樣本中，再次求得該合并樣本的標(biāo)準(zhǔn)差，從而相應(yīng)地變更其測量不確定度的取值區(qū)間。

對于結(jié)果的表達方式，由于擴張不確定度U 只能表示為lgX 的取值區(qū)間，因此要得到微生物含量的可能區(qū)間須再對其取反對數(shù)。

1 陳霞，黃玉軍，王琴，等．熱處理條件對牛乳中耐熱芽孢致死效果的影響［J］．食品研究與開發(fā)，2006，32（2）：1～6．

2 韓永霞．牛乳中芽孢桿菌的動態(tài)變化及部分生物學(xué)特性的研究［D］．呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006．

3 韓雪，張?zhí)m威．芽孢桿菌的檢測方法［J］．食品科學(xué)，2007，28（1）：347～350．

4 劉麗花，周紅，任永紅．菌落總數(shù)測定中的不確定度評定［J］．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（17）：317～318．

5 陸霄芳．食品中菌落總數(shù)檢驗結(jié)果不確定度分析［J］．疾病監(jiān)測與控制雜志，2012，6（9）：559～561．

6 李子江，林濤，鄧鐵娥．游泳池水中距離總數(shù)檢測確定度評定［J］．疾病監(jiān)測與控制雜志，2012，6（7）：421～423．

7 王曉紅，姜嫻．食品中菌落總數(shù)檢測結(jié)果的不確定度評定［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（11）：2 799～2 800．

8 凌云，王李寶，沈輝，等．食品中大腸菌群平板計數(shù)結(jié)果不確定度的評定［J］．食品與機械，2010，26（5）：75～77．