玉米赤霉烯酮飼糧添加蒙脫石對(duì)斷奶仔豬脾臟和外周血免疫指標(biāo)的影響

姜淑貞 楊維仁 楊在賓 王淑靜 劉法孝 Chi F

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院1，泰安 271018）

（Amlan International2，Chicago 60626）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是由鐮孢屬真菌產(chǎn)生的類雌激素真菌毒素［1］。目前，全世界谷物和飼料普遍受到ZEA的嚴(yán)重污染［2］。在中國(guó)，落后的谷物收獲條件和油料加工過程加重了ZEA的污染；低質(zhì)量的玉米和糧食加工副產(chǎn)品，特別是非常規(guī)原料的廣泛使用，使ZEA等霉菌毒素的污染程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國(guó)外［3］。研究表明，ZEA及其代謝物通過雌激素受體激活雌激素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［4］，引起多種動(dòng)物的雌激素中毒癥，尤其豬表現(xiàn)最敏感［5］。Jiang等［6］研究表明，斷奶母豬飼糧中添加 1 mg／kg ZEA表現(xiàn)明顯的陰戶紅腫、生殖器官腫大以及子宮角組織病理變化；相反，斷奶公豬飼糧添加1 mg／kg ZEA則導(dǎo)致生殖器官指數(shù)顯著降低。大量研究證實(shí)，ZEA還具有血液毒性［7］、基因毒性［8］和免疫毒性［9］，表明ZEA的毒性作用還可能存在與雌激素受體部位無關(guān)的其他毒性效應(yīng)機(jī)制。國(guó)內(nèi)外有關(guān)ZEA的研究主要集中在對(duì)成年繁殖母豬繁殖性能［10］和雌性斷奶仔豬外生殖器官的影響上［11］，對(duì)免疫功能影響的研究?jī)H限于體外試驗(yàn)［12］和高劑量 ZEA處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［13］。迄今為止，鮮見有關(guān)低劑量 ZEA（1 mg／kg）對(duì)斷奶仔豬免疫毒性劑量效應(yīng)關(guān)系的研究報(bào)道。鑒于ZEA的毒性和對(duì)動(dòng)物以及人類健康形成威脅，迫切需要切實(shí)可行的方法對(duì)污染ZEA的飼料和食品進(jìn)行脫毒或使毒素失活。本研究旨在以外周血和脾臟為研究對(duì)象，研究低劑量ZEA對(duì)斷奶仔豬脾臟和外周血淋巴細(xì)胞增殖率和IL－2產(chǎn)量的影響，同時(shí)評(píng)定改性蒙脫石對(duì)ZEA的脫毒效應(yīng)，從而初步揭示ZEA的免疫毒性及其可能機(jī)制，為養(yǎng)豬生產(chǎn)中脫毒劑的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 玉米赤霉烯酮（ZEA）

以色列 Fermentek（Jerusalem，Israel）公司生產(chǎn)，為色譜純，純度保證值為98%。

1.1.2 改性蒙脫石

與普通蒙脫石吸附劑相比，改性產(chǎn)品粒度更細(xì)（顆粒直徑：29μm；顆粒數(shù)：930億／kg），并經(jīng)特殊工藝對(duì)蒙脫石進(jìn)行表面活性劑改性處理。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

選擇（28±1）日齡、平均體重為（8.84±0.21）kg健康的三元（斯格×長(zhǎng)×大）雜交斷奶仔豬18頭，按照體重隨機(jī)分為3個(gè)處理，每個(gè)處理6頭（公母各半），每個(gè)重復(fù)1頭豬，各處理組間初始體重差異不顯著（P＞0.05）。

仔豬采用試驗(yàn)籠（0.48 m2）單獨(dú)飼養(yǎng)。單體籠使用塑料漏縫地板，安裝有乳頭飲水器和料槽，仔豬自由采食和飲水。試驗(yàn)開始前對(duì)豬舍進(jìn)行全面清掃、消毒，試驗(yàn)期間每周進(jìn)行一次豬舍消毒。舍內(nèi)安裝紅外保溫?zé)?，?周維持試驗(yàn)籠內(nèi)溫度在30℃左右，第2周將豬舍內(nèi)環(huán)境溫度維持在26～28℃左右。豬舍相對(duì)濕度為65%。預(yù)試期7 d，正試期22 d。試驗(yàn)在沂南金珠園豬場(chǎng)進(jìn)行。

1.3 基礎(chǔ)飼糧與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參考NRC（1998）推薦標(biāo)準(zhǔn)配制，飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。處理分別為：Contr.＝基礎(chǔ)飼糧；ZEA＋CZ0＝基礎(chǔ)飼糧＋1 mg／kg ZEA；ZEA＋CZ4＝基礎(chǔ)飼糧 ＋1 mg／kg ZEA＋4 g／kg改性蒙脫石。

1.4 試驗(yàn)飼糧的配制、養(yǎng)分含量和毒素水平的測(cè)定

1.4.1 玉米赤霉烯酮污染飼糧的配制

將色譜純度（98%）晶體粉末狀ZEA由乙酸乙酯溶解制成溶液，再將含有ZEA的乙酸乙酯溶液噴灑到一定量的滑石粉載體上，并放置過夜使乙酸乙酯揮發(fā)，制成1 000 mg／kg的ZEA預(yù)混劑，然后用不含毒素的玉米粉進(jìn)一步將1 000 mg／kg的ZEA預(yù)混劑稀釋成10 mg／kg的ZEA預(yù)混劑，最后按照試驗(yàn)飼糧中ZEA的設(shè)計(jì)水平，用ZEA預(yù)混劑替代配方中的玉米和載體配制成試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)所需飼糧需于試驗(yàn)正式開始前一周一次性配制完成，在試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束后分別取樣，用以測(cè)定常規(guī)養(yǎng)分含量以及毒素水平。

1.4.2 飼糧常規(guī)養(yǎng)分測(cè)定

飼糧常規(guī)養(yǎng)分含量按照張麗英［14］的方法進(jìn)行。粗蛋白用凱氏定氮法；能量用HR－15氧彈式熱量計(jì)；鈣用高錳酸鉀滴定法；食鹽用硫氰酸銨反滴定法測(cè)定；氨基酸用日立835－50氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 飼糧毒素測(cè)定

飼糧中ZEA、嘔吐毒素、黃曲霉毒素和煙曲霉毒素含量委托臺(tái)灣亞洲谷物檢測(cè)中心測(cè)定。嘔吐毒素采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，ZEA、黃曲霉毒素和煙曲霉毒素采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和熒光法測(cè)定。黃曲霉毒素、ZEA、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的最低檢測(cè)限為分別為1μg／kg、0.1 mg／kg、0.1 mg／kg和0.25 mg／kg。對(duì)照飼糧和試驗(yàn)飼糧中ZEA的含量分別為0和（1.03±0.04）mg／kg，所有飼糧中煙曲霉毒素的含量平均為（1.19±0.06）mg／kg，未檢測(cè)到黃曲霉毒素和嘔吐毒素。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 血樣的采集、處理與測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，對(duì)仔豬進(jìn)行空腹采血。使用真空抗凝管（內(nèi)加K2EDTA）采集耳緣全血15 mL，采血后立即混勻，置于低溫保溫箱中暫存，采血結(jié)束后，血樣立即帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增值率和IL－2產(chǎn)量。

1.5.1 外周血淋巴細(xì)胞增值率測(cè)定

1.5.1.1 外周血淋巴細(xì)胞的制備

將全血與D－h(huán)anks 1∶1稀釋，然后加入到淋巴細(xì)胞分離液（Cedarlane Laboratories Limited，Burlington，Canada.）中于2 000 r／min離心 30 min。取中間白細(xì)胞部分。用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，然后用RPMI－1640（Hyclone，USA）清洗 3次，每次離心5 min（2 000 r／min），用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），然后將外周血淋巴細(xì)胞懸浮于RPMI－1640完全培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度到2×106個(gè)／mL。

1.5.1.2 淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定

將上述細(xì)胞懸液分加于96孔培養(yǎng)板中，每孔190μL，同時(shí)加入 10μL ConA（Sigma，USA）。置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃下培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入100μL甲基噻唑基四唑鹽（MTT，Sigma，USA），繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔吸出100μL上清液后，加入100μL二甲基亞砜（DSMO）溶解紫色結(jié)晶產(chǎn)物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。以對(duì)照組吸光度值為1，其余試驗(yàn)組吸光度值和對(duì)照組相比，得出各組細(xì)胞數(shù)量相對(duì)對(duì)照組的百分比。

1.5.2 外周血淋巴細(xì)胞IL－2產(chǎn)量的測(cè)定

1.5.2.1 IL－2的體外誘生

外周血淋巴細(xì)胞的制備過程同1.5.1.1，于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入500μL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱中，在37℃下靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)板，在超凈工作臺(tái)中無菌收取上清液，－80℃下凍存?zhèn)錂z。

1.5.2.2 IL－2誘生活性檢測(cè)用靶細(xì)胞的制備

于24孔培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液1 mL和ConA（Sigma，USA）溶液 1 mL，置于 5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，收集淋巴細(xì)胞并用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心（3 000 r／min離心20 min）。用RPMI－1640完全培養(yǎng)液洗滌2次，再用α－甘露糖苷（Sigma，USA）洗滌3次。最后用含α－甘露糖苷的RPMI－1640完全培養(yǎng)液調(diào)整靶細(xì)胞濃度至8×106個(gè)／mL備用。

1.5.2.3 IL－2產(chǎn)量的測(cè)定

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入RPMI－1640完全培養(yǎng)液144μL，再加入待測(cè)樣品6μL（用RPMI－1640完全培養(yǎng)液進(jìn)行 1∶16稀釋），每孔加入靶細(xì)胞50μL。每樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)RPMI－1640完全培養(yǎng)液空白對(duì)照。置5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)每孔加入MTT溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，每孔吸出上清100μL后加入DMSO 100μL，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

1.6 脾臟樣品采集、處理和測(cè)定

采血結(jié)束后，將試驗(yàn)仔豬電擊致死后放血，打開胸腔和腹腔，首先對(duì)脾臟器官進(jìn)行肉眼觀察，并記錄病變情況。無菌剝離脾臟并稱重后，快速切取脾臟樣品置于事先準(zhǔn)備好的D－Hank’s液中，待測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖率。

1.6.1 脾臟相對(duì)重＝器官重量（g）／活體重量（kg）

1.6.2 脾臟淋巴細(xì)胞的制備和測(cè)定

脾臟樣品置于盛有適量無菌D－Hank’s液的小平皿中，將上面的脂肪等用剪刀剪掉；將脾臟樣品換到另一個(gè)盛有Hank’s液的小平皿中，將樣品剪成小塊；用鑷子輕輕將之夾起，置于200目細(xì)胞篩上研磨過濾，制成單細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液緩慢加入到用淋巴細(xì)胞分層液中，2 000 r／min離心30 min；取中間白細(xì)胞部分，用Hank’s液洗滌3次，每次離心5 min（2 000 r／min），用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），然后將脾淋巴細(xì)胞懸浮于RPMI－1640完全培養(yǎng)液并調(diào)整細(xì)胞密度到2×106個(gè)／mL。

1.6.3 脾臟淋巴細(xì)胞增值率和IL－2產(chǎn)量測(cè)定

脾臟淋巴細(xì)胞增值率和IL－2產(chǎn)量的測(cè)定方法同外周血淋巴細(xì)胞增值率、IL－2產(chǎn)量的測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SAS 9.1［15］計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，處理間差異采用單因子方差（one－Way ANOVA）分析進(jìn)行。采用正交多項(xiàng)式比較法對(duì)不同改性蒙脫石梯度的處理效應(yīng)進(jìn)行一次線性回歸分析，用Duncan’s多組極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 脾臟相對(duì)重量

ZEA污染飼糧及添加改性蒙脫石對(duì)斷奶仔豬脾臟相對(duì)重量的影響見表2。與對(duì)照組相比，1 mg／kg ZEA處理組脾臟相對(duì)重量顯著降低（P＜0.05）。與1 mg／kg ZEA處理組相比，飼糧添加4 g／kg改性蒙脫石顯著增加仔豬脾臟相對(duì)重量（P＜0.05）。

2.2 外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖率

ZEA污染飼糧及添加改性蒙脫石對(duì)斷奶仔豬外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖率（Lymphocyte proliferation rate，LPR）的影響見表 2。與對(duì)照組相比，1 mg／kg ZEA處理顯著降低外周血和脾臟LPR（P＜0.05）。與ZEA處理組相比，添加4 g／kg改性蒙脫石顯著提高外周血和脾臟LPR（P＜0.05）。

2.3 外周血和脾臟淋巴細(xì)胞IL－2產(chǎn)量

ZEA污染飼糧及添加改性蒙脫石對(duì)斷奶仔豬外周血和脾臟淋巴細(xì)胞IL－2產(chǎn)量的影響見表2。與對(duì)照組相比，1 mg／kg ZEA處理顯著降低外周血和脾臟淋巴細(xì)胞IL－2產(chǎn)量（P＜0.05）。與ZEA處理組相比，添加4 g／kg改性蒙脫石使外周血和脾臟IL－2顯著增加（P＜0.05）。

表2 ZEA污染飼糧添加改性蒙脫石對(duì)斷奶仔豬脾臟重、外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖率以及IL－2產(chǎn)量的影響

3 討論

3.1 玉米赤霉烯酮對(duì)仔豬免疫功能的影響

脾臟為動(dòng)物體內(nèi)主要的免疫器官，其發(fā)育的狀態(tài)或其與體重的比值（指數(shù)）直接影響動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)功能。有關(guān)ZEA對(duì)動(dòng)物脾臟指數(shù)的研究報(bào)道很少。Rsell等［16］研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶雌鼠飼喂添加ZEA（10 mg／kg，相當(dāng)于 1.5 mg／kg／d）飼糧 8周后，沒有影響脾臟與體重和脾臟與腦重的比率，也沒有觀察到脾臟的組織病理學(xué)變化。Abbès等［13］以 40 mg／kg BW ZEA飼糧（相當(dāng)于1 mg ZEA／d）處理小鼠，發(fā)現(xiàn)脾臟組織病理學(xué)改變。本研究中，仔豬飼糧添加1 mg／kg水平的ZEA顯著降低仔豬脾臟器官指數(shù)，表明低劑量ZEA（1 mg／kg）可能通過抑制免疫器官的生長(zhǎng)降低仔豬免疫功能。

測(cè)定淋巴細(xì)胞體外增殖是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)，也是檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能的常用方法之一。淋巴細(xì)胞增殖是機(jī)體免疫系統(tǒng)受到外來抗原刺激后產(chǎn)生的正常的保護(hù)性生理反應(yīng)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平［17］。ZEA、α－ZOL和β－ZOL能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒性，研究證實(shí)5～10 mol／L的ZEA及其代謝物抑制牛的嗜中性白細(xì)胞［18］，抑制絲裂原誘導(dǎo)的B、T淋巴細(xì)胞的增殖［19］。即使低濃度的 ZEA（10μmol／L）也能抑制胸腺瘤Jurkat T細(xì)胞的增殖，并證實(shí)這種抑制作用是由ZEA誘導(dǎo) T細(xì)胞凋亡引起的［20］。體外試驗(yàn)表明，ZEA能抑制植物血凝素刺激的人外周血淋巴細(xì)胞增殖，還能抑制刀豆素A和美洲商陸有絲分裂原刺激的B細(xì)胞和T細(xì)胞形成［12］。本研究采用MTT法揭示了ZEA可降低外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，提示ZEA對(duì)外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖具有抑制作用，進(jìn)而對(duì)仔豬淋巴細(xì)胞的免疫功能產(chǎn)生一定影響。

IL－2是T細(xì)胞增殖、分化必不可少的細(xì)胞因子，因此又被稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子。在體內(nèi)，產(chǎn)生IL－2的細(xì)胞主要是T細(xì)胞，但一些前體T細(xì)胞和前體B細(xì)胞也能產(chǎn)生IL－2。近年來，IL－2常作為分子疫苗佐劑用于增強(qiáng)疫苗的免疫效果，尤其是增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。已有研究表明，用編碼鼠IL－2的質(zhì)粒與丙型肝炎病毒核心蛋白DNA疫苗共同免疫小鼠后，可引起CD4＋T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。陳創(chuàng)夫等［21］用構(gòu)建的IL－2與豬瘟病毒E2基因的真核雙表達(dá)質(zhì)粒載體免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)免疫效果比單表達(dá)E2基因的質(zhì)粒好。α－ZOL（40和80μmol）顯著降低胸腺瘤T細(xì)胞 IL－2的表達(dá)水平［20］。本試驗(yàn)中，1 mg／kg ZEA處理組仔豬外周血和脾臟IL－2顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），由于IL－2是T細(xì)胞增殖、分化必不可少的細(xì)胞因子，ZEA誘導(dǎo)外周血和脾臟IL－2水平降低可以解釋外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖率下降的原因。

3.2 改性蒙脫石對(duì)低劑量玉米赤霉烯酮的脫毒效應(yīng)

本研究中ZEA劑量的選擇是根據(jù)大量的飼料原料和產(chǎn)品調(diào)查結(jié)果以及本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果確定的［22－23］。雖然在配料時(shí)盡力選擇優(yōu)質(zhì)原料，但試驗(yàn)飼糧中還是檢測(cè)到了煙曲霉毒素（1.1～1.3 mg／kg），這也充分反映了我國(guó)飼料原料霉菌污染的普遍性。盡管不能排除煙曲霉毒素與ZEA協(xié)同對(duì)仔豬的毒性效應(yīng)，但是由于本試驗(yàn)飼糧中煙曲霉毒素的水平低于美國(guó)糧食農(nóng)業(yè)組織規(guī)定的小于10 mg／kg［24］和歐盟關(guān)于仔豬飼糧中FUM小于5 mg／kg［25］的最高限量規(guī)定，且本試驗(yàn)飼糧中所有處理中煙曲霉毒素水平一致，因此可以認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果的差異是由ZEA和不同水平吸附劑引起的。

蒙脫石吸附劑對(duì)黃曲霉毒素有很明顯的正效應(yīng)［26］，主要是由于黃曲霉毒素的β－二羰基基團(tuán)具有極性，它的分子能夠進(jìn)入蒙脫石層間，與層間可交換性陽離子產(chǎn)生鰲合作用。然而他們對(duì)ZEA和DON的作用卻差異很大，ZEA和DON極性的降低是影響吸附劑與毒素親和力的主要原因［27］。因此，用有機(jī)陽離子對(duì)層狀硅酸鹽黏土進(jìn)行化學(xué)修飾，增加礦物質(zhì)表面的疏水性，以改善其對(duì)ZEA和DON等非極性毒素的吸收是非常有效的方法。在含有1.3 mg／kg ZEA的飼糧中添加天然黏土吸附劑能有效改善ZEA對(duì)仔豬生殖器官產(chǎn)生的有害作用［22］。高劑量ZEA（40 mg／kg BW）飼糧添加 600或 800 mg／kg的水合硅鋁酸鹽顯著改善ZEA誘導(dǎo)的小鼠IgA和IgG的降低水平［13］。但改性蒙脫石吸附劑對(duì)ZEA免疫抑制的保護(hù)作用文獻(xiàn)很少。本研究中添加4 g／kg改性蒙脫石可顯著改善1 mg／kg ZEA誘導(dǎo)的免疫抑制作用。這些結(jié)果表明，改性蒙脫石吸附劑可能在消化道內(nèi)與ZEA形成牢固的復(fù)合物，從而減少了ZEA在小腸的吸收，但需進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié)論

4.1 飼糧中添加1 mg／kg的ZEA顯著降低斷奶仔豬脾臟相對(duì)重量、外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖率和IL－2產(chǎn)量。

4.2 1 mg／kg的ZEA處理飼糧添加4 g／kg改性蒙脫石吸附劑能夠顯著改善ZEA誘導(dǎo)的脾臟和外周血淋巴細(xì)胞增值率和IL－2的改變。

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