Beclin1和Atg5在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義

鄧琦程，王福萍，高愛華，朱維培，史 明，錢志紅，張 弘

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州215004)

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)3 大惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但由于其起病較為隱匿，早期診斷困難，故卵巢癌臨床確診時(shí)70%已屬晚期。卵巢癌術(shù)后易復(fù)發(fā)，且易出現(xiàn)腹盆腔及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首［1］。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，近期有研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生發(fā)展與自噬活性的改變有關(guān)［2］。自噬相關(guān)基因Beclin1 和Atg5 是參與自噬調(diào)控的重要基因，本研究采用免疫組化和RT-PCR 檢測其在不同卵巢組織中的表達(dá)情況，探討B(tài)eclin1 和Atg5 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

采用蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院2011—2012年手術(shù)標(biāo)本，共90 例，其中正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤、上皮性卵巢癌各30 例。正常卵巢組織來源于畸胎瘤手術(shù)中畸胎瘤旁正常卵巢上皮、子宮肌瘤行子宮及附件切除者的卵巢，惡性性卵巢癌組織中漿液性15 例，黏液性9 例;淋巴轉(zhuǎn)移6 例;按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO 2000)臨床分期及病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期3例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期5 例;組織學(xué)分級(jí):G1期10 例，G2 期15 例，G3 期5 例。標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，均未接受術(shù)前放療、化療。

1.2 主要試劑

免疫組化主要試劑:Beclin1 和Atg5 兔抗單克隆抗體(EPITMICS 公司);過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒(上?；蚬?。RT-PCR 主要試劑:反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas 公司);PCR 引物(由Invitrogen 公司合成)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色檢測與陽性結(jié)果判定:采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidinperosidase，SP)，按試劑盒要求進(jìn)行操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，對(duì)抗原采用高壓熱修復(fù)，依次滴加過氧化物酶阻斷劑(37 ℃避光孵育15 min)，第一抗體(室溫孵育30 min)，生物素標(biāo)志的第二抗體(室溫孵育30 min)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。陽性結(jié)果判定:胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。綜合切片中細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行半定量分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)為:背景清晰無色為陰性(－ )，陽性細(xì)胞＜25%為弱陽性(+ )，25% ～75% 為陽性(++)，＞75%為強(qiáng)陽性(+ + +)，弱陽性及陽性為低表達(dá)，強(qiáng)陽性為高表達(dá)。每張切片至少觀察5個(gè)高倍鏡視野。

1.3.2 RT-PCR:1)組織RNA 的提取:每份凍存標(biāo)本取1 mm3剪碎研磨，加入1 mL Trizol(總RNA 提取試劑)溶液裂解后經(jīng)氯仿等提取細(xì)胞總RNA 以DNA/RNA 測定儀測定RNA 的純度和濃度，調(diào)整mRNA 的濃度在1.8 ～2.0。2)cDNA 的合成按反錄試劑盒說明合成。3)PCR 反應(yīng)Beclin1 引物序列:5'-CAAGATCCTGGACCGTGTCA-3'(上游引物)，5'-GTGACGTTGAGCTGAGTGT-3'(下游引物)，目的片段為372 bp。Atg5 引物序列:5'-ATGACAGATGACA AAGATGTGC-3' (上游引物)，5'-TGTGCCTTCATA TTCAAACC-3'(下游引物)，目的片段為225 bp。以β-actin 作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系為:2 × PCR Master-Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL，去離子水7 μL，總體積為20 μL。PCR 條件為:94 ℃30 s，55 ℃30 s，74 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，以目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度值與內(nèi)參β-actin 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度值的比值表示目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，RT-PCR半定量數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)水平采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測結(jié)果

Beclin1 和Atg5 蛋白在不同卵巢組織中的表達(dá)情況:Beclin1 蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤、上皮性卵巢癌組織中的陽性率分別為83.3%、70%和36.7%，上皮性卵巢癌中Beclin1 蛋白的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤(P＜0.01)(圖1)。Atg5 蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，強(qiáng)陽性時(shí)，細(xì)胞系中也有表達(dá)。在正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤中的陽性率分別為73.3%、60%，顯著高于上皮性卵巢癌中的33.3%，與正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤相比(P＜0.05)(圖2)。

2.2 RT-PCR 檢測結(jié)果

上皮性卵巢癌組織中Beclin1 和Atg5 的mRNA含量低于卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織(P＜0.01)(表1，圖3)。

表1 各組織中Atg5 與Beclin1 的mRNA 表達(dá)Table 1 Expressions of Atg5 and Beclin1 mRNA in different ovarian tissues(±s，n=30)

表1 各組織中Atg5 與Beclin1 的mRNA 表達(dá)Table 1 Expressions of Atg5 and Beclin1 mRNA in different ovarian tissues(±s，n=30)

#P＜0.01 compared with normal ovarian tissues group;*P＜0.01 compared with benign ovarian tumor tissues group．

groupBeclin1Atg5 normal ovarian tissues0.695 ±0.1220.624 ±0.145 benign ovarian tumor tissues 0.615 ±0.1190.523 ±0.133 ovarian cancer tissues0.243 ±0.104#*0.300 ±0.116#*

2.3 上皮性卵巢癌組織中Beclin1 與Atg5 蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

上皮性卵巢癌組織中Beclin1 與Atg5 蛋白表達(dá)及腫瘤的細(xì)胞分化程度、組織分期之間顯著相關(guān)(P＜0.05)(表2)。

3 討論

自噬是在自噬相關(guān)基因 (autophagy related gene，Atg)的調(diào)控下將細(xì)胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)和一些內(nèi)源性底物在單位膜包裹的自噬囊泡中降解的過程，在維持細(xì)胞代謝平衡及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面至關(guān)重要［3］。自噬活性的改變將影響細(xì)胞的生長、增殖，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

圖3 Atg5 和Beclin1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig 3 PCR results of Atg5 and Beclin1 gene

表2 卵巢上皮性癌組織中Beclin1 與Atg5 的表達(dá)及臨床病理學(xué)特征的聯(lián)系Table 2 The potential relations between expressions of Beclin1 and Atg5 protein and clinical pathological features

Beclin1 基因(也稱BECN1 基因)，是第一個(gè)被鑒定的自噬基因，由Aita 于1999年發(fā)現(xiàn)其位于人類染色體17q21 上，是酵母自噬基因atg6/vps30 的同源物［4］。Beclin1 可以通過提高細(xì)胞自噬抑制腫瘤的生長，是候選的腫瘤抑制基因，Beclin1/ hVps34 復(fù)合物參與自噬體形成的早期階段，為前自噬體的形成招募其他ATG 蛋白［5］，是參與自噬調(diào)控的重要基因。研究表明乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤與Beclin1 基因功能的缺失相關(guān)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)Beclin1 蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示卵巢癌的發(fā)生可能與自噬活性的降低有關(guān)。Atg5 位于人類染色體6q21，包含384 個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism，SNP)，編碼276 個(gè)氨基酸［7］。在自噬體膜形成的早期階段，需要兩個(gè)類泛素蛋白系統(tǒng)介導(dǎo):Atg5-Atg12和Atg8-PE.Atg5 與Atg12 形成的復(fù)合物，定位于自噬體膜的表面促進(jìn)自噬體膜的伸展擴(kuò)張，誘導(dǎo)自噬體的形成，在酵母和哺乳動(dòng)物中去除Atg5 能阻滯自噬［8］，因此，Atg5 在自噬中起重要作用。本研究通過免疫組化和RT-PCR 顯示，Atg5 在上皮性癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，提示上皮性卵巢癌組織中存在Atg5 表達(dá)的缺失和下調(diào)。自噬發(fā)生時(shí)，Atg5 的形成量減少，即在上皮性卵巢癌組織中自噬活性下降，這種可變性可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生。對(duì)Beclin1、Atg5 蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病例參數(shù)關(guān)系的分析表明，隨著腫瘤分化程度的下降以及FIGO 分期的提高，Beclin1、Atg5 表達(dá)減少，提示上皮性卵巢癌的進(jìn)展可能與自噬活性的下降有關(guān)。

本研究通過免疫組化和RT-PCR 的方法比較正常卵巢組織、良性卵巢組織及上皮性卵巢癌組織中Beclin1 和Atg5 的表達(dá)，研究結(jié)果表明Beclin1和Atg5 在上皮性卵巢癌中的表達(dá)顯著降低，提示上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展可能與自噬活性的下降有關(guān)。目前自噬的機(jī)制尚未完全闡明，隨著對(duì)自噬進(jìn)一步的研究，可了解自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體過程，為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶向治療方案。

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