木犀草素預(yù)處理減輕H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡

印媛君，余美榮，蔣福生，丁志山

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室;2.生命科學(xué)院分子遺傳教研室，浙江杭州310053)

心臟疾病發(fā)病率的逐年增加，已經(jīng)引起越來越多醫(yī)務(wù)人員以及普通老百姓的關(guān)注，如何預(yù)防以及減低發(fā)病率已經(jīng)成為越來越多人關(guān)心的問題了。木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，多以糖苷形式存在于多種植物中，具有多種藥理活性，尤其在對(duì)心血管保護(hù)方面的作用被逐漸重視，如對(duì)氧化應(yīng)激大鼠心肌的保護(hù)［1］，對(duì)阿霉素?fù)p傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)［2］以及對(duì)冷保存心臟功能的保護(hù)［3］等。本研究對(duì)木犀草素預(yù)處理后對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響做了初步研究，探討木犀草素在心血管疾病預(yù)防中可能發(fā)揮的意義，以期為該化合物的進(jìn)一步研究提供一定的依據(jù)，以及為如何有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生1 ～3 d 的SD 乳鼠，購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào) SYXK (浙)2009-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

木犀草素(純度大于97%)，(浙江天草生物制品有限公司);高糖DMEM 培養(yǎng)基(Gibogo 公司);胎牛血清(Hyclone 公司);Hoechst33342-PI(碧云天生物技術(shù)研究所);胰蛋白酶(1∶250)，5-溴-2-脫氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine)，噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司);乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)［4］。

1.3.2 MTT 法測(cè)心肌細(xì)胞存活力:心肌細(xì)胞懸液接種到96 孔板，分7 組，每組6 孔。設(shè)置對(duì)照組、模型組和木犀草素預(yù)處理組。另設(shè)無細(xì)胞空白孔，消除培養(yǎng)基對(duì)吸光度的影響。對(duì)照組(control):以含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)細(xì)胞;模型組(model):培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L 的H2O2孵育2 h;木犀草素預(yù)處理組:培養(yǎng)后，用不同濃度的木犀草素預(yù)處理2 h，隨后每孔加入終濃度為1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)液處理2 h 后每孔內(nèi)再加MTT 20 μL(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去各孔中含MTT 的培養(yǎng)液，每孔加DMSO 100 μL，混合均勻后用酶標(biāo)儀測(cè)A 值(測(cè)定波長(zhǎng)490 nm)。根據(jù)下式計(jì)算藥物對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的抑制百分比。損傷抑制率(%)=(A drug－A model)×100/(A control－A model)。

1.3.3 分組及藥物處理:根據(jù)MTT 活性及損傷抑制率的測(cè)定，木犀草素預(yù)處理組選擇濃度為100 μmol/L。故實(shí)驗(yàn)分成3 組，即對(duì)照組、模型組和木犀草素預(yù)處理組(100 μm 木犀草素預(yù)處理2 h+1 mmol/L H2O2處理2 h)。

1.3.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:長(zhǎng)在6 孔板中的細(xì)胞，各組在相差倒置顯微鏡觀察并照相，觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3.2 心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的測(cè)定:不同處理后的心肌細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率。每孔選8 個(gè)細(xì)胞或同步收縮的細(xì)胞簇，鏡下計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞跳動(dòng)1 min，重復(fù)兩次。

1.3.3.3 Hoechst33342-PI 雙染色后觀察細(xì)胞系染色，測(cè)量細(xì)胞凋亡。

1.3.3.4 熒光染料羅丹明123(Rh123)染色觀察細(xì)胞線粒體:在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，細(xì)胞系周圍綠色的亮點(diǎn)即為攝取了Rh123 的線粒體。用ImageJ 軟件分析5 個(gè)視野的綠色熒光強(qiáng)度平均值，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3.5 LDH、MDA、SOD 的檢測(cè):分別吸取以上各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按測(cè)試盒說明書測(cè)定LDH、MDA 水平與SOD 活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 木犀草素預(yù)處理對(duì)H2O2 損傷的心肌細(xì)胞存活力的影響

模型組A 值顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，10 μmol/L以上木犀草素預(yù)處理組，顯著回升(P＜0.01)，模型組與對(duì)照組差異具有顯著性。而1 μmol/L的木犀草素預(yù)處理組A 值顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，而木犀草素大、中劑量組對(duì)H2O2損傷的心肌細(xì)胞均有保護(hù)作用。因此，選用100 μmol/L木犀草素預(yù)處理組，作為接下去的實(shí)驗(yàn)組(表1)。

表1 心肌細(xì)胞MTT A 值及損傷抑制率Table 1 MTT A value of myocardial cells and inhibition rate of injury(±s，n=6)

表1 心肌細(xì)胞MTT A 值及損傷抑制率Table 1 MTT A value of myocardial cells and inhibition rate of injury(±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupA valueinhibiton rate(%)CON0.517 ±0.060 model0.377 ±0.036*LUT 200 μmol/L+ H2O20.618 ±0.017#156.98 LUT 100 μmol/L+ H2O20.515 ±0.054#98.88 LUT 50 μmol/L+ H2O20.509 ±0.035#95.53 LUT 10 μmol/L+ H2O20.521 ±0.039#102.23 LUT 1 μmol/L+ H2O20.395 ±0.026*31.84

2.2 不同處理因素心肌細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果

由顯微鏡下可見，正常培養(yǎng)組(圖1A)的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)飽滿，同步搏動(dòng)有力，邊緣清晰，分布均勻，相鄰細(xì)胞伸出偽足偶聯(lián)成簇;模型組(圖1B)用1 mmol/L 的H2O2誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，皺縮變圓，偽足減少，細(xì)胞體積明顯減小、瘦癟，細(xì)胞間隙大，活性差，細(xì)胞搏動(dòng)減少甚至無搏動(dòng)，培養(yǎng)液中懸浮死細(xì)胞增多;而用木犀草素預(yù)處理后(圖1C)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好，與對(duì)照組相似。由此表明木犀草素預(yù)處理后對(duì)H2O2損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

2.3 心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的測(cè)定結(jié)果

模型組心跳顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，木犀草素預(yù)處理組搏動(dòng)頻率回升(P＜0.01)(表2)。

表2 心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率Table 2 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=8)

表2 心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率Table 2 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupfrequency (times/min)CON100 ±9 model64 ±6*LUT 100 μmol/L+1 mmol/L H2O296 ±8#

2.4 Hoechst 33342-PI 雙染色后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察［5］

用Hoechst33342-PI 雙染后，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化來評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。33342-PI 熒光染色顯示，正常培養(yǎng)組細(xì)胞系呈均勻藍(lán)色，少見核碎裂、核濃染(圖2A)，幾乎沒有細(xì)胞壞死(圖2B);而模型組細(xì)胞存活明顯減少，致密濃染核增多，核碎裂明顯多于對(duì)照組(圖2C)，壞死細(xì)胞也明顯增加(圖2D);木犀草素預(yù)處理組與對(duì)照組類似(圖E/F)。

2.5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測(cè)定［6］

圖1 顯微鏡下觀察不同組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化Fig 1 Different groups under the microscope morphological changes of myocardial cells(×200)

Rh123 是一種能夠被線粒體所吸收的熒光染料，線粒體對(duì)其攝取能力取決于其跨膜電位，攝取能力越強(qiáng)，跨膜電位越大。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以間接反映MMP 的高低。因此結(jié)果顯示，對(duì)照組(圖3A)活細(xì)胞數(shù)量多，形態(tài)良好，線粒體功能良好，熒光顯示充足;而模型組(圖3B)染料在線粒體內(nèi)聚集的少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，熒光顯示儲(chǔ)存不良;木犀草素預(yù)處理組(圖3C)與對(duì)照組結(jié)果相似。從表3 可知，模型組熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，木犀草素預(yù)處理組，與對(duì)照組無差異，與模型組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。模型組與對(duì)照組差異具有顯著性，說明H2O2損傷模型成立，模型組心肌細(xì)胞可使線粒體對(duì)Rh123 的攝取能力明顯降低，表明MMP 下降。木犀草素預(yù)處理后可以使線粒體對(duì)Rh123 的攝取能力明顯提高，提示木犀草素能保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗H2O2對(duì)MMP的抑制作用，對(duì)細(xì)胞存在良好的保護(hù)作用。

表3 熒光染料羅丹明123(Rh123)染色后熒光強(qiáng)度測(cè)量Table 3 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=6)

表3 熒光染料羅丹明123(Rh123)染色后熒光強(qiáng)度測(cè)量Table 3 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupfluorescence intensity CON13.48 ±0.32 model11.29 ±0.51*LUT 100 μmol/L+1 mmol/L H2O213.99 ±0.44#

2.6 木犀草素對(duì)H2O2 損傷心肌細(xì)胞LDH、SOD及MDA 的影響

表4 可知，模型組LDH 和MDA 值顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，而SOD 值顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，木犀草素預(yù)處理組，與對(duì)照組無差異。模型組與對(duì)照組差異具有顯著性，說明H2O2損傷模型成立，木犀草素預(yù)處理組可減少H2O2損傷后LDH 從細(xì)胞內(nèi)的漏出量，使細(xì)胞內(nèi)SOD 含量增加，使MDA 生成量減少，與模型組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，木犀草素預(yù)處理后對(duì)H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

表4 木犀草素對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞LDH、SOD和MDA 的影響Table 4 Affect of luteolin about LDH，SOD and MDA on myocardial cells injured by H2O2(±s，n=8)

表4 木犀草素對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞LDH、SOD和MDA 的影響Table 4 Affect of luteolin about LDH，SOD and MDA on myocardial cells injured by H2O2(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupLDH(U/L)SOD(U/L) MDA(nmol/L)CON5.37 ±0.3344.47 ±0.980.34 ±0.03 model16.12 ±0.45* 23.59 ±0.66* 0.83 ±0.04*LUT 100 μmol/L±1 mmol/L H2O2 5.39 ±0.32# 43.40 ±1.19# 0.32 ±0.03#

3 討論

凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)性死亡，心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致心臟功能發(fā)生退行性改變，因此在心臟疾病發(fā)生過程中，凋亡的發(fā)生是不可避免的，如果對(duì)凋亡過程進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)則可保護(hù)心肌功能，心臟疾病的發(fā)展勢(shì)必會(huì)緩慢下來。細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧自由基，損傷細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。H2O2是體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物，它不僅能直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)及蛋白，而且能自由穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)生成OH 等活性更強(qiáng)的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)。離體實(shí)驗(yàn)中，H2O2損傷可模擬體內(nèi)多種心臟疾病的病理狀態(tài)，如心肌細(xì)胞缺血缺氧等病理過程，其損傷模型是常見的研究缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭弧?/p>

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，存在于多種植物中，如中藥野菊花、金銀花、紫蘇等中含量較高。其具有多種藥理活性，如保護(hù)心血管［7］、抗氧化［8］、抗炎［9］、抑制凋亡［10］、舒張血管［11］等多種生物學(xué)作用，其不良反應(yīng)低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上證明木犀草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷造成的缺血缺氧的乳鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，結(jié)果提示木犀草素的作用機(jī)制與提高心肌細(xì)胞活力，穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化損傷能力，減少脂質(zhì)過氧化物導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷，抑制細(xì)胞凋亡及壞死，保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體膜電位及功能等因素有關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)所用化合物是由浙江天草生物制品有限公司從花生殼中提取出來的，說明花生殼中含有具有生物活性的化學(xué)成分，具有一定的開發(fā)價(jià)值，可以拓展花生資源的綜合開發(fā)利用。當(dāng)然由于中藥野菊花、金銀花、紫蘇等中木犀草素含量較高，如果用木犀草素預(yù)處理后對(duì)過氧化氫所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用，那么像金銀花、野菊花等泡茶是否具有心臟保護(hù)作用就可以進(jìn)一步的研究了，也為預(yù)防心臟疾病的發(fā)生提供一條新思路。

［1］杜貫濤，彭蘊(yùn)茹，劉國(guó)卿．木犀草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］．江蘇中醫(yī)藥，2006，27:74－75．

［2］何玲，孫桂波，孫瀟，等．木犀草苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28:1229－1234．

［3］閆慶峰，閆高峰，李躍萍，等．木犀草素對(duì)冷保存心臟功能及心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］．中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2012，12:393－395．

［4］陳妍，王振遠(yuǎn)，郭秀俠，等．乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)［J］．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2006，19:520－521．

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［7］杜貫濤，彭蘊(yùn)茹，劉國(guó)卿．木犀草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］．江蘇中醫(yī)藥，2006，27:74－75．

［8］牟艷玲，胡志力，周玲，等．木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］．山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33:63－65．

［9］張新娟，左國(guó)營(yíng)，王濤，等．木犀草素與抗菌藥體外聯(lián)用抗耐甲氧西林金葡菌的作用研究［J］．藥學(xué)進(jìn)展，2012，36:173－179．

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［11］章李軍，凌霜，陳剛領(lǐng)，等．野菊花提取物舒張血管及抗炎機(jī)制研究［J］．上海中醫(yī)藥雜志．2009，43:60－63．