結(jié)縷草種質(zhì)抗銹病表現(xiàn)田間聯(lián)合測試與抗性種質(zhì)篩選

范少先，王小山，谷光璞，孫潔峰，王赟文

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院草業(yè)科學系 北京市草業(yè)科學重點實驗室，北京 100193；2.揚州大學動物科學與技術(shù)學院草業(yè)科學系，江蘇 揚州 225000； 3.海源草坪有限公司，山東 膠州 266300)

結(jié)縷草(Zoysiajaponica)也稱日本結(jié)縷草，是當今世界上公認的優(yōu)良草坪草[1]，適應性廣，耐干旱、受病蟲和病害影響相對較小[2]，低養(yǎng)護管理下表現(xiàn)也很好。銹病是一種常見的氣傳性結(jié)縷草真菌病害，由結(jié)縷草柄銹菌(Pucciniazoysiae)引起，主要危害其葉片和葉鞘[3-4]，發(fā)病普遍、持續(xù)時間長。在發(fā)病初期，受害部位出現(xiàn)褪綠斑點，隨著病害加重，在病部形成黃銹色皰狀孢子堆，繼而散發(fā)出橙黃色夏孢子。有風時，銹病孢子隨風迅速蔓延，引起大片病害，嚴重時會導致植物枯萎死亡。銹病的發(fā)生和發(fā)展，使結(jié)縷草草坪的觀賞和坪用價值顯著降低[5]。何秋等[5]報道結(jié)縷草銹病在南京全年有4個發(fā)病高峰，其中6月中旬、7月中旬和8月上旬分別有3個發(fā)病小高峰，而10月下旬達到發(fā)病大高峰。通過結(jié)縷草屬的日本結(jié)縷草、中華結(jié)縷草(Z.sinica)、溝葉結(jié)縷草(Z.matrella)和細葉結(jié)縷草(Z.tenuifolia)4個種的種內(nèi)和種間組配形成14個雜交組合，獲得68份種質(zhì)材料[6]。對這些材料的銹病發(fā)病規(guī)律和嚴重程度的調(diào)查表明，種內(nèi)雜交后代的始病期、耐病性和發(fā)病程度均優(yōu)于親本[6]。張露明[7]對收集的162個結(jié)縷草種在北京地區(qū)進行了銹病發(fā)生情況田間和溫室接種測定，結(jié)果表明，北京地區(qū)結(jié)縷草銹病病情指數(shù)整體呈單峰型，病情始發(fā)期于6月初至7月中旬，發(fā)病高峰期集中于9月中旬至10月上旬；參試種質(zhì)材料田間抗銹性鑒定篩選和溫室接種抗性鑒定結(jié)果基本一致，以其中的11個抗病單株和11個感病單株，對67對已確定的與抗銹病基因緊密連鎖的小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)和多年生黑麥草(Loliumperenne)SSR標記進行適用性擴增篩選，能夠有效擴增的引物為35對，其中具有明顯多態(tài)性條帶的有28對，占參試引物的41.8%；多年生黑麥草抗冠銹病(P.coronataf.sp.lolii)QTL連鎖的LpSSR01A07和LpSSR059 SSR標記和小麥抗稈銹病(P.graminisf.sp.tritici)主效基因Sr2連鎖的Xgwm533 SSR標記在參試的結(jié)縷草銹病抗感材料之間具有較為一致的多態(tài)性表現(xiàn)。

培育抗銹病的結(jié)縷草品種是一種長期有效防治結(jié)縷草銹病危害的方法，具有經(jīng)濟、環(huán)保和持續(xù)時間較長等優(yōu)點。抗病品種選育前提是種質(zhì)資源的收集與準確評價。考慮到造成植物銹病發(fā)生的病原菌，生理小種的多樣性，以及病害發(fā)生受環(huán)境條件作用而表現(xiàn)出的地域性特點，本研究利用張露明[7]初步評價獲得的40余份結(jié)縷草種質(zhì)材料，通過分株營養(yǎng)繁殖的方法，同時在山東省膠州市和江蘇省揚州市兩地，按照抗病、感病和對照3組進行聯(lián)合測試，旨在：1)在更大的地域范圍內(nèi)確定抗銹病種質(zhì)的表現(xiàn)型；2)研究環(huán)境與銹病抗、感表現(xiàn)型的互作關(guān)系；3)從原始群體中按照高抗和高感進行歧化選擇的有效性。

1 材料與方法

1.1供試材料 在張露明[7]對參試的162份結(jié)縷草單株營養(yǎng)體種質(zhì)材料進行評價的基礎上，選擇17份感病、19份抗病和26份隨機選擇的單株種質(zhì)材料，形成感病、抗病和對照種質(zhì)材料群體，通過同一單株材料分株營養(yǎng)繁殖的方法，分別在2010年7月和8月移栽到位于山東省膠州市營海工業(yè)園的膠州海源草坪有限公司院內(nèi)(36°15′52″ N，120°00′48″ E，海拔50 m)和江蘇省揚州市揚州大學揚子津校區(qū)動物科技學院草業(yè)科學系試驗地(32°22′45″ N，119°23′33″ E，海拔35 m)。每份材料重復3次，小區(qū)面積1 m×1 m，各小區(qū)間距1 m，隨機區(qū)組排列。由于移栽后個別參試植株未能成活，以及從平衡區(qū)組設計的統(tǒng)計分析需要考慮，兩個參試地點僅對3次重復均成活的材料進行統(tǒng)計分析。各地點兩個年份實際分析的種質(zhì)材料數(shù)量見表1。山東省膠州市試驗地因道路施工原因，2011年測試的材料較上一年有所減少。

試驗地主要管理措施是日常除草和切斷匍匐莖，防止相鄰小區(qū)植株相互入侵。在江蘇省揚州市試驗點，為促進株叢生長和擴展，在2011年4月初剪草1次，不灌溉和施肥。山東省膠州市則為自然生長，植株移栽后灌溉3次，其后不灌溉和施肥。

1.2銹病發(fā)病程度調(diào)查 分別于2010年10月23日和2011年10月22日對山東省膠州市試驗點結(jié)縷草參試種質(zhì)材料的銹病田間發(fā)病情況進行了觀測，其中2010年根據(jù)植株葉片的病葉率情況統(tǒng)計了發(fā)病嚴重度指標，2011年則調(diào)查了發(fā)病嚴重度和病葉率兩項指標。2011年11月9日觀測了江蘇省揚州市試驗點參試結(jié)縷草種質(zhì)材料的銹病田間發(fā)病嚴重度和病葉率兩項指標。

病葉率調(diào)查是根據(jù)參試種質(zhì)株叢發(fā)病的葉片占所有綠色葉片的比例目測估計得到，并根據(jù)株叢病葉率及嚴重程度評估參試材料的發(fā)病嚴重度。嚴重度劃分為8個等級，分值為0～7。具體分級標準為：0級，未發(fā)?。?級，病葉率為1%～5%，發(fā)病較輕，夏孢子零星分布；2級，病葉率為6%～10%，發(fā)病輕微，夏孢子密度?。?級，病葉率為11%～20%，發(fā)病中等，夏孢子均勻分布；4級，病葉率為21%～40%，發(fā)病略重，夏孢子密度大；5級，病葉率為41%～60%，發(fā)病較重，夏孢子多且密度更大；6級，病葉率為61%～80%，發(fā)病嚴重，夏孢子成堆排列；7級，病葉率為81%～100%，發(fā)病很重，夏孢子幾乎鋪滿葉片。

根據(jù)參試結(jié)縷草發(fā)病嚴重度，可將其侵染型劃分為4類：0分(未發(fā)病)、0.1～1.9分(高度抗病)、2.0～2.9分(中度抗病)、3.0～3.9分(中度感病)、4分以上(高度感病)。

1.3數(shù)據(jù)分析 首先單獨對每個試驗地點在2010年和2011年的觀測結(jié)果進行方差分析。方差分析模型為作物品系性狀早期比較試驗常用的分組內(nèi)重復設計的統(tǒng)計分析線性模型[8]。測驗:1)抗病、感病和對照3組之間銹病病葉率和(或)發(fā)病嚴重度的差異顯著性；2)上述3組內(nèi)參試種質(zhì)之間差異的顯著性；3)區(qū)組的環(huán)境誤差、區(qū)組與組內(nèi)種質(zhì)材料的互作效應。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Bartlett測驗和Levene測驗表明參試樣本的方差同質(zhì)。其次，將2010年和2011年山東省膠州市、2011年江蘇省揚州市觀測結(jié)果視為3個獨立的環(huán)境測定結(jié)果，根據(jù)袁志發(fā)和周靜芋[9]介紹的作物多地點方差分析模型，對3個點-年環(huán)境、參試種質(zhì)材料、參試材料與點-年環(huán)境之間的互作、試驗誤差進行顯著性測驗，從而確定抗病與感病種質(zhì)材料性狀表現(xiàn)受環(huán)境的作用效應。以上統(tǒng)計分析均采用SAS 8.2軟件GLM命令編程實現(xiàn)。

表1 山東省膠州市和江蘇省揚州市參試材料來源和數(shù)量Table 1 Tested zoysiagrass materials origin and number

2 結(jié)果與分析

2.1江蘇省揚州市試驗點觀測結(jié)果 江蘇省揚州市移栽的參試材料中，從抗銹病、感銹病和對照群體中對分株種植后3次重復均存活的材料(各14份合計42份材料)的2011年結(jié)縷草銹病病葉率和發(fā)病嚴重度進行方差分析。結(jié)果表明，抗銹病、感銹病和對照組3個類型之間，結(jié)縷草銹病病葉率和發(fā)病嚴重度差異極顯著(P<0.001)，各類型內(nèi)的參試材料觀測指標的差異極顯著(P<0.001)，而重復間差異則不顯著(P>0.05)(表2-5)。從結(jié)縷草葉片的銹病發(fā)病比較來看，抗銹病群體(31.0%)<感銹病群體(48.5%)<對照群體(55.6%)，而從發(fā)病嚴重度比較，抗銹病群體(2.5)<對照群體(2.7)<感銹病群體(3.8)。這一結(jié)果反映出之前對抗銹病和感銹病群體進行的篩選在群體水平上取得了明顯的效果。

表2 2011年揚州市感銹病結(jié)縷草參試材料發(fā)病情況Table 2 Rust disease assessment of susceptible zoysiagrass lines at Yangzhou in 2011

表3 2011年揚州市對照結(jié)縷草參試材料發(fā)病情況Table 3 Rust disease assessment of control zoysiagrass lines at Yangzhou in 2011

表4 2011年揚州市抗銹病結(jié)縷草參試材料發(fā)病情況Table 4 Rust disease assessment of resistant zoysiagrass lines at Yangzhou in 2011

表5 2011年揚市州對照、抗銹病和感銹病抗銹病結(jié)縷草參試材料發(fā)病情況方差分析Table 5 Rust disease assessment of control,resistant,and susceptible zoysiagrass lines at Yangzhou in 2011

進一步分析感病、抗病和對照3組當中各銹病種質(zhì)材料的組成比例，感病群體中中度感病和高度感病的材料共有10個，占感病群體總數(shù)的71.4%；抗病群體中中度抗病、高度抗病和未發(fā)病的材料共有9份，占64.3%；而對照群體抗病材料6份和感病材料8份，比例大體相當(表2-5)。參試種質(zhì)材料當中，抗病表現(xiàn)最強的是從山東半島收集的11-1和2-2兩份材料，而最易感病的材料是從山東半島收集的2-5和3-6。

2.2山東省膠州市2010年和2011年試驗點觀測結(jié)果 山東省膠州市試驗點2011年結(jié)縷草銹病的總體發(fā)病程度較2010年嚴重。利用從2010年移栽膠州市試驗點的參試材料當中，抗銹病、感銹病和對照群體中隨機選取分株種植后3次重復均存活的材料各8份，共24份材料對當年銹病發(fā)病嚴重度進行方差分析。結(jié)果表明，抗銹病、感銹病和對照組3個類型之間，結(jié)縷草銹病發(fā)病嚴重度的差異極顯著(P<0.001)，各類型內(nèi)的參試材料觀測指標的差異極顯著(P<0.001)，而重復間差異則不顯著(P>0.05)(表6)。抗銹病群體和對照群體的平均發(fā)病嚴重度均小于感銹病群體。感病群體以中感和高感為主，共有7份，占87.5%，抗病群體材料當年均未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，對照材料的發(fā)病嚴重程度比較低(表6)。

2011年，對抗銹病、感銹病和對照群體各7份材料，共計21份材料對當年的銹病病葉率和發(fā)病嚴重度進行方差分析。各分組的差異顯著性與上年相同(表7)，而銹病病葉率則表現(xiàn)出抗銹病群體(0.3%)<對照群體(78.7%)<感病群體(95.5%)，發(fā)病嚴重度比較，抗銹病群體(0.3)<對照群體(5.5)<感銹病群體(6.9)(表6)，與2011年江蘇省揚州市試驗點的結(jié)果(表2-4)相似。

綜合2010和2011年山東省膠州市試驗點的觀測結(jié)果，參試的抗病群體中11-1和11-3均未發(fā)??；2-2和2-3在2010年均未發(fā)病，而在2011年表現(xiàn)為高抗；感病群體中的9-5和14-1兩年觀測均表現(xiàn)為感病，感病程度略有不同；而12-1在2010年表現(xiàn)為中抗，2011年表現(xiàn)高感(表6)。

表6 參試結(jié)縷草種質(zhì)材料在山東省膠州市2010年和2011年發(fā)病情況Table 6 Rust disease assessment at Jiaozhou, Shandong in 2010 and 2011

表7 山東省膠州市2010年和2011年參試種質(zhì)材料銹病評價結(jié)果的方差分析Table 7 F-test for rust disease parameters of tested accessions at Jiaozhou, Shandong in 2010 and 2011

表8 膠州市和揚州市兩地兩年發(fā)病嚴重度聯(lián)合測試Table 8 Combined testing of rust disease percent severity of two locations in two years

表9 膠州市和揚州市兩地兩年發(fā)病嚴重度聯(lián)合測試方差分析Table 9 F-test for combined testing of rust disease percent severity of two locations in two years

2.3兩個地點3次觀測結(jié)果的聯(lián)合測試 對上述參試材料當中，從江蘇省揚州市和山東省膠州市兩個地點、兩年3次觀測數(shù)據(jù)結(jié)果完整的抗銹病、感銹病和對照群體中各取5份材料，對結(jié)縷草發(fā)病嚴重度進行聯(lián)合方差分析。結(jié)果表明，江蘇省揚州市和山東省膠州市兩個地點的發(fā)病嚴重度差異極顯著(P<0.001)，抗銹病、感銹病和對照組3個類型之間，發(fā)病嚴重度差異極顯著(P<0.001)，而各地點重復之間差異不顯著(P>0.05)(表8-9)。這一結(jié)果表明，結(jié)縷草銹病的發(fā)病情況存在地域性差異，同時在所收集的種質(zhì)材料當中，進行的抗病和感病選擇取得了顯著效應。

參試材料當中，11-1、2-2和2-3在兩地3次觀測均表現(xiàn)為抗病，且11-1均表現(xiàn)未發(fā)病，可作為抗銹病親本進一步選育抗銹病結(jié)縷草品種；11-3材料在山東省膠州市2年觀測結(jié)果中表現(xiàn)抗病，但在2011年江蘇省揚州市觀測中表現(xiàn)為感病，不排除兩地發(fā)生的結(jié)縷草銹病的病原菌存在不同的生理小種；而3份感病材料9-5、12-1和14-1在3次觀測中均表現(xiàn)為感病(表8)。

3 討論

結(jié)縷草銹病在結(jié)縷草屬3種主要的草坪草種(日本結(jié)縷草、溝葉結(jié)縷草和細葉結(jié)縷草)上均有發(fā)病報道，是一種流行廣泛、對結(jié)縷草草坪危害較為嚴重的專性寄生的真菌病害。當夏孢子附著在葉片表面，溫度和濕度合適時，夏孢子萌發(fā)侵染結(jié)縷草葉片。銹菌夏孢子的萌發(fā)和侵入最適溫度為15～22 ℃，相對濕度為100%或葉片表面有水膜的條件下萌發(fā)，適宜的潛育期為8～12 d。當夏季空氣濕度很大時，降水或者灌溉導致排水不良的地區(qū)容易導致結(jié)縷草銹病大流行。結(jié)縷草銹病的發(fā)病起始期及其發(fā)病程度會因不同經(jīng)緯度和當?shù)貪穸茸兓兴煌?。美國堪薩斯州結(jié)縷草銹病8-9月初發(fā)病，病情持續(xù)整個秋季；而阿拉巴馬州，結(jié)縷草銹病病情指數(shù)分別在5月和7月達到兩個高峰期；我國遼寧等地區(qū)結(jié)縷草銹病的發(fā)病時期為7月末-10月初。北京地區(qū)結(jié)縷草銹病病情指數(shù)呈單峰型，病情始發(fā)期集中于6月初-7月中旬，發(fā)病高峰為9月中旬-10月上旬。重慶結(jié)縷草銹病主要發(fā)生于4月上旬，5月上中旬出現(xiàn)第1次高峰，6月初，葉片上出現(xiàn)冬孢子堆。8月銹病發(fā)生停止，9月中旬，葉片有產(chǎn)生夏孢子和冬孢子堆，10月形成第2次高峰，11月下旬-12月初病害停止[10]。南京地區(qū)結(jié)縷草屬植物銹病始病期集中在5月初-6月初，冬孢子堆在9月中旬-10月中旬出現(xiàn)，全年病情指數(shù)在7月中旬-8月上旬及10月下旬-11月上旬兩個高峰期[5]。本研究表明，在位于長江流域的江蘇省揚州市和山東半島的膠州地區(qū)，結(jié)縷草銹病的發(fā)病程度存在年份和地點之間的差異。由此可見，受溫度和濕度等環(huán)境條件影響，結(jié)縷草銹病發(fā)病時期和嚴重程度均不同，位于我國長江中下游的揚州、南京等地結(jié)縷草的發(fā)病期長，發(fā)病程度較北方地區(qū)嚴重，可以作為結(jié)縷草種質(zhì)抗銹病性狀評價的適宜地點。

除溫度和濕度等環(huán)境因素影響外，結(jié)縷草銹病的發(fā)病與病情危害程度還受到病原菌及其轉(zhuǎn)主寄主等因素的影響。銹菌生活史中可產(chǎn)生最多5種類型的孢子：性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔孢子。Harada[11]報道了結(jié)縷草銹菌的銹孢子、夏孢子和冬孢子亮視野顯微形態(tài)照片。Dery和Kulik[12]報道了結(jié)縷草銹菌的銹孢子、夏孢子和冬孢子對結(jié)縷草和雞矢藤侵染和生長的情況。Asuyama[13]提出結(jié)縷草銹菌的轉(zhuǎn)主寄主為藤本植物雞矢藤(Paederiascandens)，廣泛分布在我國長江流域及以南各省區(qū)。然而，目前國內(nèi)外均沒有在自然條件下從轉(zhuǎn)主寄主雞矢藤上發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草銹菌的報道。結(jié)縷草銹菌是一種典型的長生活史的銹菌，能夠在沒有轉(zhuǎn)主寄主的條件下在結(jié)縷草屬植物上完成寄生存活。在一個生長季，銹菌夏孢子可以連續(xù)產(chǎn)生多次，不斷傳播。在禾草莖葉周年存活的地方，銹菌以夏孢子或菌絲體在發(fā)病部位越冬。在寒冷地區(qū)，冬季禾草地上部分死亡的地區(qū)，銹菌的夏孢子或菌絲體不能越冬，而產(chǎn)生的冬孢子不易萌發(fā)，在侵染循環(huán)中作用不大，第2年春季由越冬地區(qū)隨氣流傳來的夏孢子引起新的侵染[14]。轉(zhuǎn)主寄主雞矢藤的存在與否對兩地結(jié)縷草銹病的發(fā)生和流行的影響還有待進一步研究。

本研究在廣泛收集結(jié)縷草種質(zhì)材料的基礎上，通過田間和溫室接種病原菌后銹病發(fā)病情況，篩選出抗病和感病的種質(zhì)材料。通過江蘇省揚州市和山東省膠州市兩地的3次觀測，抗病材料和感病材料總體表現(xiàn)出顯著的差異，表明結(jié)縷草抗銹病選擇的有效性。同時，這些歧化選擇獲得的材料也為通過雜交構(gòu)建作圖群體，進而篩選連鎖分子標記或發(fā)掘性狀關(guān)聯(lián)位點提供了理想的親本材料。植物抗病性的持久性除取決于病原菌毒性基因質(zhì)量及環(huán)境條件的影響外，還取決于抗病基因的品質(zhì)[15-17]。發(fā)掘、利用高品質(zhì)抗銹基因?qū)τ谂嘤共∑贩N至關(guān)重要。一般來說，抗銹病種質(zhì)有數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀的不同，研究者們將其分為垂直抗性、水平抗性和慢銹性[18-20]。垂直抗性受環(huán)境影響較大，抗銹病性狀不穩(wěn)定；水平抗性受環(huán)境影響相對較小，可表現(xiàn)出穩(wěn)定抗性；慢銹性表現(xiàn)為推遲發(fā)病[21-23]。對于評價獲得的11-1、2-2和2-3等抗病材料，其抗病遺傳機制、性狀的遺傳率和對應的病原菌生理小種等情況也是下一步需要著重研究的內(nèi)容。

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