煙草內(nèi)生促生細(xì)菌的篩選及在漂浮育苗中的應(yīng)用效果

陳澤斌，楊躍華，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，陳海如

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，玉溪 653100;2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明650201;3 云南省煙草公司玉溪市公司，玉溪 653100

植物體是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，健康植物體內(nèi)還有大量的內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生細(xì)菌可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高寄主植物的生長(zhǎng)勢(shì)，保持植物良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，提高植物自身的抗病能力[1-2]。前人研究還表明，內(nèi)生細(xì)菌可以通過生物固氮[3]活化并促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素如氮磷鉀等大量元素和鐵等微量元素的吸收[4]，產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)刺激調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，如植物激素、酸性物質(zhì)以及維生素等[5]，提高植物抗旱性、抗鹽堿性、抗極端溫度和pH值、抗重金屬毒害等，提高宿主植物的逆境生存能力[6-7]，對(duì)植物病害具有防治作用[6]等。

目前對(duì)內(nèi)生促生菌的篩選和使用主要在水稻苗、棉花、白菜[8-10]上有一些研究，在煙草上尚未見報(bào)道。如能從煙草體內(nèi)篩選出對(duì)煙草生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的有益菌，可為內(nèi)生促生菌的促生長(zhǎng)作用原理的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。鑒于云南生態(tài)多樣性，生物多樣性，微生物種類多，煙草種植面積大的特點(diǎn)。筆者對(duì)云南省主栽煙草品種大量采樣，從煙草的不同組織中分離出多種內(nèi)生細(xì)菌，從中篩選出了對(duì)煙草有促生作用的菌株，并對(duì)其在煙草漂浮育苗中的應(yīng)用效果進(jìn)行了初步研究，以期將促生效果最佳的菌株應(yīng)用于煙葉生產(chǎn)中。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和煙草品種

烤煙品種K326裸種由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供；煙草內(nèi)生細(xì)菌為2010年采用平板稀釋法從云南省不同煙區(qū)、不同煙草品種、不同生長(zhǎng)期的葉及成熟期的根、莖分離獲得[11]。

1.2 培養(yǎng)基、主要試劑及儀器

內(nèi)生細(xì)菌的活化用NA[12]、液體培養(yǎng)用LB[12]。內(nèi)生細(xì)菌DNA提取、16S rDNA片段擴(kuò)增、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程產(chǎn)品。

1.3 內(nèi)生促生細(xì)菌的篩選

1.3.1 培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗(yàn)初篩

斜面保存的菌種在NA平板上活化后接種到LB培養(yǎng)液中，于28℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h后，制成108cfu/mL濃度的菌懸液備用（在600 nm處調(diào)整菌懸液光密度為0.5±0.02）。

挑選飽滿、大小一致的K326裸種，70%的酒精消毒1分鐘，無菌水清洗3次后均勻播于鋪有2層濾紙的9 cm無菌培養(yǎng)皿中，每皿注入稀釋10倍的上述菌懸液4 mL，每20粒種子為一個(gè)重復(fù)，每菌株3次重復(fù)，設(shè)置清水對(duì)照和LB培養(yǎng)液對(duì)照，置于人工智能氣候箱中培養(yǎng)，（光強(qiáng)：70%；光照：12 h/d；晝夜溫度：25℃；相對(duì)濕度：70%）每隔1 d補(bǔ)充無菌水1 mL，以確保種子正常萌發(fā)，于第7天分別統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，第14天測(cè)量煙苗根長(zhǎng)、根體積。根長(zhǎng)及根體積的測(cè)量采用加拿大Regent公司的WinRHIZO根系分析系統(tǒng)。

1.3.2 漂浮育苗試驗(yàn)復(fù)篩

將初步篩選出的促生細(xì)菌按1.3.1中方法制成菌懸液，種子消毒處理同1.3.1，利用漂浮育苗盤對(duì)初步篩選到的促生內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行再次篩選。在煙苗2片真葉時(shí)鑒苗，挑選成長(zhǎng)整齊一致的的煙草幼苗移栽至漂浮育苗盤，用稀釋10倍的上述菌懸液對(duì)煙苗進(jìn)行噴霧處理，每個(gè)處理4株，5次重復(fù)，每株噴霧菌液5 mL。每隔7 d噴霧1次，以等量的無菌水和LB培養(yǎng)液處理作為對(duì)照，連續(xù)處理60 d，60 d后取樣測(cè)量煙苗生長(zhǎng)形態(tài)指標(biāo)，最終篩選出煙苗促生細(xì)菌。

1.4 內(nèi)生促生細(xì)菌wy2在煙草漂浮育苗中的應(yīng)用效果研究

將菌株wy2接種于LB培養(yǎng)液中，于28℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h后，12000 r/min離心后分別收集菌體（wy2菌）和上清（wy2），菌體用無菌水洗滌離心兩次后重懸于無菌水中，在600 nm處調(diào)整菌懸液光密度為0.5±0.02即為菌體懸浮液。2011年9 - 10月在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和試驗(yàn)基地采用溫室漂浮育苗方式進(jìn)行試驗(yàn)，在煙苗2片真葉時(shí)，分別用稀釋10倍后的上清（wy2）及菌體懸浮液（wy2菌）噴霧處理煙苗，每個(gè)處理132株煙苗（一盤），2次重復(fù)，每盤噴霧200 mL。每隔7 d噴霧1次，以等量的無菌水和LB培養(yǎng)液處理作為對(duì)照，連續(xù)處理60 d，分別于第48 d、55 d、62 d取樣測(cè)定每株煙草幼苗的莖鮮重、莖粗、莖高、根長(zhǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2003軟件和DPS 7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 內(nèi)生促生細(xì)菌wy2的16S rDNA鑒定

細(xì)菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit，方法參見試劑盒說明書。PCR擴(kuò)增選用引物F27/R1492[13]，常規(guī)條件擴(kuò)增[14]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fication Kit回收后，連接于載體pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，挑取白色菌落以M13F/M13R為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性克隆委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的16S rDNA 全序列用EzTaxon server (http∶//www.eztaxon.org/)進(jìn)行同源性搜索[15]，并用Mega 4.0軟件，將該序列與已報(bào)道的芽孢桿菌菌株的16S rDNA全序列進(jìn)行同源性比較，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗(yàn)初篩

通過在培養(yǎng)皿中進(jìn)行的發(fā)芽試驗(yàn)，測(cè)定了127株內(nèi)生細(xì)菌處理后煙草種子的發(fā)芽率、根長(zhǎng)和根體積，淘汰了會(huì)不同程度降低煙草種子發(fā)芽率和抑制煙草種子萌發(fā)的菌株，在經(jīng)過重復(fù)多次的發(fā)芽試驗(yàn)后篩選出了4株在不同程度上對(duì)煙草有促生性的內(nèi)生細(xì)菌。從表1可以看出，水和LB培養(yǎng)液作用于煙草種子，平均發(fā)芽率分別為75.0%和81.7%。煙草種子經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌cg15、cg16、wy2、wy3處理后，發(fā)芽率、根長(zhǎng)和根體積與對(duì)照相比均有提高，發(fā)芽率提高了16.3%-20.3%，各菌株之間的差異順序是：cg16＞wy2=cg15＞wy3。根長(zhǎng)提高了25.1%-30.3%，各菌株之間的差異順序是：wy2＞cg15=cg16＞wy3。根體積提高了50%-100%，各菌株之間的差異順序是：wy2＞cg15=wy3＞cg16。菌液處理組與對(duì)照組差異均達(dá)顯著水平。各處理煙草種子萌發(fā)的情況見圖1，可見所有經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌處理過的煙草種子根長(zhǎng)均長(zhǎng)于對(duì)照，菌液處理組在根的數(shù)量上也明顯高于對(duì)照且子葉寬厚、葉色蔥綠。說明cg15、cg16、wy2、wy3不僅能有效促進(jìn)煙草種子萌發(fā)而且對(duì)煙草根系生長(zhǎng)也有積極的促進(jìn)作用。

表 1 不同菌株發(fā)酵液處理對(duì)煙草種子萌發(fā)、根長(zhǎng)及根體積的影響

圖1 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響

2.2 漂浮育苗試驗(yàn)復(fù)篩

對(duì)培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗(yàn)初篩得到的4株菌，通過漂浮育苗盤進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選。參試菌株各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)見表2，除cg15外其余菌株各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)均好于清水對(duì)照和LB對(duì)照，其中以wy2最好，wy3次之，cg16第三。圖2顯示，所有經(jīng)促生細(xì)菌處理過的煙苗根長(zhǎng)均長(zhǎng)于對(duì)照，菌液處理組較對(duì)照組根系更發(fā)達(dá)，而對(duì)照組根系長(zhǎng)勢(shì)較弱，根系不發(fā)達(dá)。從對(duì)莖直徑的影響來看，wy2、wy3、cg16對(duì)莖直徑的影響達(dá)顯著水平，分別比LB對(duì)照增加了33.3%、17.8%和20.0%，cg15則沒有顯著地促進(jìn)或抑制效果。從對(duì)根長(zhǎng)的影響來看，除了cg15處理的根長(zhǎng)低于對(duì)照組以外，其余菌株處理的煙苗根長(zhǎng)較對(duì)照均有提高，但除了wy2以外，wy3和cg16處理與對(duì)照差異不顯著，經(jīng)wy2處理的煙苗根長(zhǎng)比LB對(duì)照長(zhǎng)出49.2%。從株高、莖鮮重、葉重、最大葉長(zhǎng)最大葉寬來看，菌液處理的煙苗各項(xiàng)指標(biāo)較對(duì)照有所提高，但變化不大，總體上與對(duì)照無明顯差異。說明菌液處理對(duì)地上部分生物量沒有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)地下部分生物量有顯著的促進(jìn)作用。用以上各指標(biāo)對(duì)各菌株的促生性做綜合評(píng)價(jià)，其中以wy2對(duì)煙苗的促生效果最佳，順序是：wy2＞wy3＞cg16＞cg15。

表2 參試菌株各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)

圖2 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草幼苗根長(zhǎng)的影響

2.3 內(nèi)生促生細(xì)菌wy2在煙草漂浮育苗中的應(yīng)用效果研究

復(fù)篩結(jié)果表明，wy2對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育確實(shí)有明顯穩(wěn)定的促生作用，為了探究wy2的活性是由什么成分在起作用，是由菌體活細(xì)胞還是菌體的胞外分泌物，為此，我們分別用菌體活細(xì)胞懸浮液和菌體發(fā)酵液上清噴霧處理煙草漂浮苗，在株齡48 d、55 d、62 d調(diào)查每處理對(duì)煙草漂浮苗莖鮮重、莖直徑、莖高和根長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4、圖5、圖6。圖3顯示，菌體活細(xì)胞懸浮液在株齡48 d和55 d對(duì)莖鮮重的影響達(dá)顯著水平，平均比LB對(duì)照增重了0.22 g和0.56 g，在株齡62 d時(shí)菌體處理組雖然高于對(duì)照組，但與對(duì)照無顯著差異。發(fā)酵液上清處理莖鮮重在整個(gè)生育期中都與對(duì)照無顯著差異。圖4顯示，菌體活細(xì)胞懸浮液處理和發(fā)酵液上清處理在株齡48 d時(shí)對(duì)莖直徑的影響達(dá)顯著水平，平均比LB對(duì)照增粗了0.26 mm和0.05 mm，而在株齡55 d的時(shí)候，僅菌體懸浮液處理與LB對(duì)照有顯著差異，相比LB對(duì)照處理，莖直徑增粗了0.48 mm，發(fā)酵液上清處理莖直徑與LB對(duì)照無差異。在株齡62 d的時(shí)候，菌體處理組雖然高于對(duì)照組，但與對(duì)照無顯著差異。圖5顯示，在株齡48 d和55 d的時(shí)候，菌體懸浮液處理組莖高與LB對(duì)照相比差異達(dá)顯著水平。莖高平均比對(duì)照增加了1.31 cm和1.46 cm，而發(fā)酵液上清液處理對(duì)莖高的影響未達(dá)顯著。在株齡62 d的時(shí)候，兩種處理莖高與LB對(duì)照相比差異不顯著。圖6顯示，在株齡48 d的時(shí)候，菌體懸浮液處理根長(zhǎng)與LB對(duì)照處理差異顯著，根長(zhǎng)平均比LB對(duì)照長(zhǎng)70.61 cm。發(fā)酵液上清液處理根長(zhǎng)與LB對(duì)照處理差異顯著，與清水對(duì)照處理差異不顯著。在株齡55 d的時(shí)候，菌體懸浮液處理組根長(zhǎng)長(zhǎng)于LB對(duì)照，但差異未達(dá)顯著，與清水對(duì)照差異顯著。發(fā)酵液上清處理與LB對(duì)照差異不顯著。在株齡62 d的時(shí)候，兩處理與LB對(duì)照都無差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌體活細(xì)胞懸浮液對(duì)煙苗有比較明顯和相對(duì)普遍的促生長(zhǎng)作用。尤其是在株齡48 d和55 d的時(shí)候，煙苗的莖鮮重、莖粗、莖高、根長(zhǎng)均高于LB對(duì)照，且與對(duì)照差異顯著。而發(fā)酵液上清液在整個(gè)煙草苗床期中對(duì)煙苗的生長(zhǎng)沒有顯著地影響，其莖鮮重、莖粗、莖高、根長(zhǎng)與對(duì)照相近或比對(duì)照差。說明菌體是對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育有促生作用的活性成分。發(fā)酵液上清液對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育并無促生作用。

圖3 促生細(xì)菌對(duì)莖鮮重的影響

圖4 促生細(xì)菌對(duì)莖粗的影響

圖5 促生細(xì)菌對(duì)莖高的影響

圖6 促生細(xì)菌對(duì)根長(zhǎng)的影響

2.4 內(nèi)生促生細(xì)菌wy2的16S rDNA鑒定

測(cè)序結(jié)果表明菌株wy2的16S rDNA全序列長(zhǎng)度為1514 bp，將測(cè)得的16S rDNA全序列用EzTaxon server (http∶//www.eztaxon.org/)進(jìn)行同源性搜索[15]，與其同源性最高的菌為解淀粉芽孢桿菌相似性為99%。在Ribosomal Database數(shù)據(jù)庫(kù)中選取10株屬于Bacillus屬的不同種的芽孢桿菌模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹查看屬種間的遺傳進(jìn)化關(guān)系（圖7），從系統(tǒng)發(fā)育樹看，wy11與B.amyloliquefaciens(GU826160)處于同一分支，說明兩者的遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，因此將菌株wy2鑒定為B. amyloliquefaciens(JQ936679)。

圖7 菌株wy2的16S rDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究對(duì)127株煙草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗(yàn)，由于試驗(yàn)初期首先進(jìn)行了皿內(nèi)促生的濃度梯度預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液稀釋10倍促生效果最為理想，因此本試驗(yàn)選用此濃度作為菌株發(fā)酵液的供試濃度。從中選出4個(gè)菌株作為重點(diǎn)菌，進(jìn)一步對(duì)這4株菌進(jìn)行了漂浮育苗試驗(yàn)復(fù)篩，最后挑選出1株對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育確實(shí)有明顯穩(wěn)定的促生作用的細(xì)菌wy2，經(jīng)過溫室漂浮育苗試驗(yàn)的驗(yàn)證，結(jié)果和復(fù)篩試驗(yàn)基本一致，表明通過這種篩選途徑得到的促生菌株是有效的。wy2對(duì)煙苗根長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，推斷wy2可能是通過促進(jìn)根的生長(zhǎng)和分節(jié)，增大根重，有效提高了幼苗的根系功能，從而更高效的促進(jìn)煙苗對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而促進(jìn)了葉片的光合作用，使得煙苗莖直徑增加，鮮重增加。

本文在植物生育前期噴灑wy2菌液后，使苗床期煙苗在苗齡48 d和55 d時(shí)的莖鮮重、莖粗、莖高、根長(zhǎng)得到不同程度的提高，這對(duì)于促進(jìn)煙苗的早發(fā)快長(zhǎng)是很有意義的。但在苗齡62 d的時(shí)候，各處理與對(duì)照差異不顯著?？赡芤?yàn)榻泳椒ㄋ?，葉面噴施促生細(xì)菌對(duì)煙草植株生態(tài)系的改造可能是暫時(shí)的，作用也是有限的，下一步可以探索最合適的接菌方法，以便從微生物角度使煙株長(zhǎng)期處于一個(gè)最利于發(fā)揮豐產(chǎn)性狀的穩(wěn)定的微生態(tài)系。

在試驗(yàn)過程中，尤其是漂浮育苗試驗(yàn)，雖然每次結(jié)果4個(gè)菌株大都比對(duì)照有明顯效果，尤其表現(xiàn)在對(duì)根長(zhǎng)的促生方面，但是，同一菌株在不同試驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間和試驗(yàn)次數(shù)中均表現(xiàn)出有一點(diǎn)差異，這意味著篩選到的促生內(nèi)生細(xì)菌，由于生態(tài)環(huán)境條件等的不同，其作用效果常常會(huì)表現(xiàn)出某些不穩(wěn)定性。

4 結(jié)語

篩選到的解淀粉芽孢桿菌wy2是煙草內(nèi)生促生細(xì)菌，對(duì)煙草種子萌發(fā)、莖粗、根系生長(zhǎng)有積極的促進(jìn)作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道的植物內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生某些促生物質(zhì)，并直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)的結(jié)論一致[16]。由于菌株wy2處理對(duì)煙草幼苗的株高、最大葉寬、最大葉長(zhǎng)沒有顯著影響，而只顯著增加其莖粗和根長(zhǎng)，說明內(nèi)生細(xì)菌wy2的促生作用主要針對(duì)于輸導(dǎo)組織，這為菌株的促生作用機(jī)理研究提供了方向。

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