云煙97巨型變異煙株的組織培養(yǎng)與快速繁殖

何余勇，羅定棋，趙磊峰，張永輝，謝強，年夫照，謝云波，雷曉

1四川省煙草公司瀘州市公司技術中心，瀘州646000；2 云南農業(yè)大學煙草學院，昆明650201

煙草（NicotianatabacumLinn.）是我國重要經濟作物之一，有效葉數(shù)是影響煙葉經濟產量的重要因素[1]。煙草一般采用有性繁殖，雜交育種技術繁瑣且受自然條件限制較多，不能較好地克服品種自然退化的問題，甚至出現(xiàn)大面積的苗床帶毒苗流入生產，造成嚴重的經濟損失[2-3]?？緹熎贩N具有很強的區(qū)域適應性，在自然選擇作用下偶爾會形成巨型變異株系，顯著特點是有效葉數(shù)多、開花結實晚或者困難，這在我國煙區(qū)均有報道[1,4-5]，是烤煙遺傳育種和推廣應用的重要來源。2006年，在云南昆明發(fā)現(xiàn)一株“紅花大金元”巨型變異株，后經系統(tǒng)選育形成烤煙YK01品系，變異株系適應性較廣、農藝性狀可調控閾值大、產量產值高、煙葉品質良好、可用性強，多項指標已近似或超過其親本紅花大金元，對有效利用土地具有重要意義[6]，在感官質量評吸上，變異品系與常規(guī)“紅花大金元”風格特征接近。

巨型變異株具有葉數(shù)多、品質優(yōu)等綜合表現(xiàn)，但在中高海拔煙區(qū)開花結實困難，給遺傳資源的保存與開發(fā)帶來阻礙，組織培養(yǎng)技術興起較好地解決了“變異煙株結實困難”問題。目前，關于烤煙組織培養(yǎng)的報道不斷增多[7-10]，為保持變異煙株的優(yōu)良性狀，加快優(yōu)良品系的開發(fā)提供了技術支撐，從而達到選育高產抗病優(yōu)質新品種目的[5]。但既有報道關于烤煙變異煙株組織培養(yǎng)的報道不多，特別是關于烤煙變異煙株組織培養(yǎng)過程以及激素配比等還需進一步探索。2011年，在四川瀘州發(fā)現(xiàn)一株云煙97巨型變異煙株，有效葉片60余片并未開花結實，煙葉烤后多為桔色，原煙外觀質量、經濟價值與云煙97接近。為保存優(yōu)良遺傳資源和加快變異品系應用，本研究以云煙97該巨型變異株系為材料，采用組織培養(yǎng)技術獲得了再生組培苗，通過研究不同激素、激素的不同濃度對再生苗的影響，篩選出云煙97變異煙株快速繁殖的培養(yǎng)基配方，并對植物激素的種類、濃度、配比等進行了詳細研究，對外植體切塊時間和植物激素添加時間進行了探討，進一步豐富了中高海拔地區(qū)巨型變異煙株組培快繁體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云煙97變異煙株來源于瀘州古藺向陽煙葉基地（圖1），取煙杈嫩葉作為外植體。

圖1 云煙97巨型變異煙株田間長勢

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試 驗 采 取 誘 導 培 養(yǎng) 基 1（6-BA2 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1）誘導愈傷組織；誘導培養(yǎng)基2分 別 設 MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.1mg·L-1、MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1、MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.3mg·L-1三個濃度配方，分析NAA對不定芽增殖的影響；誘導培養(yǎng)基3設1/2MS+6-BA 0.20 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1、1/2MS+6-BA 0.10 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1、1/2MS+6-BA 0.05 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1三個濃度配方，以不添加激素為對照，分析6-BA濃度對根誘導的影響。在愈傷組織形成芽點10 d、15 d、20 d和25 d外植體切塊，分析不同切塊時間對叢芽增殖的影響；設置滅菌前加激素、滅菌后加激素兩個處理，以不加植物激素為對照，探索激素加入方式對不定芽增殖的影響。所用培養(yǎng)基pH均為5.8，12h光照，26℃±1℃條件培養(yǎng)。

1.2.2 煉苗和移栽

無根幼苗約10 d后長出新根，生根培養(yǎng)20 d后將組培瓶蓋打開，繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中，2 d后移到與培養(yǎng)溫度相同的溫室中煉苗，使嫩苗逐漸與外界接觸，注意保持較高的空氣濕度。煉苗7 d后，用鑷子把苗從培養(yǎng)瓶中取出，用流水將根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，然后移入已消毒的基質中漂浮培養(yǎng)，注意及時噴水保持濕度，20 d后移栽入土。

1.2.3 統(tǒng)計方法

試驗中，設置愈傷組織不同切塊時間、不同激素濃度配比、不同的激素加入方式等對組培效率的影響，觀察記錄變異煙株組織培養(yǎng)過程變化情況，利用Excel2007、SPSS對試驗相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，按照以下公式進行：

2 結果與分析

2.1 愈傷組織形成與再分化成苗的過程觀察

外植體轉接在誘導培養(yǎng)基1后約2～3 d，開始卷曲、增厚、膨脹，之后變成圓拱形，5～7 d后外植體表面積增大50%～70%，葉片顏色變深（圖2-A）；繼續(xù)培養(yǎng)至12～14 d，外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的半透明愈傷組織（圖2-B）；繼續(xù)在培養(yǎng)基1上培養(yǎng)至6-7 d，可見大量的2-4 mm的叢生芽（圖2-C）形成，此時轉接到培養(yǎng)基2上誘導芽的增殖和再生芽的分化（圖2-D）；20-25 d后，再生芽分化形成可見的小苗（圖2- E、F）；將可見的小苗逐一切下，轉接到培養(yǎng)基3上誘導根系分化，約15-20 d后，形成明顯可見的主根系，并逐漸分化出側根系再生煙株（圖2- G）；煉苗7-10 d后，將生根的組培苗移栽至烤煙育苗基質上，7-10 d后即可還苗（圖2-H）。

圖2 云煙97巨型變異煙株組織培養(yǎng)與快速繁殖過程

2.2 愈傷組織的切塊時間對外植體叢芽增殖的影響

分別于10 d、15 d、20 d和25 d將外植體切塊，分析不同切塊時間對叢芽增殖的影響。從圖3和圖4可以看出，10 d的切塊效果較差，叢芽增殖效率較低，增殖倍數(shù)僅為1.82，有效芽數(shù)和分化成芽率為3.15%（圖4-A）；15 d、20 d切塊外植體叢生芽增殖效果較好，褐變數(shù)量較少，增殖倍數(shù)分別達到2.94和2.78，分化成芽率分別為35.16%、34.00%（圖4-B、C）；25d切塊的效果稍差，外植體褐變數(shù)量最大，褐變率較高，有效芽數(shù)和分化成芽率也低于15 d、20 d處理（圖4-D、E）。

圖 3 愈傷組織的切塊時間對外植體分化成芽率和增殖倍數(shù)的影響

這說明切塊時間太早，愈傷組織尚未形成一定數(shù)量的小芽，芽點數(shù)較少，增殖倍數(shù)自然較低；15 d、20 d的切塊處理，愈傷組織芽數(shù)較適宜，增殖效果較好，分化成芽率較高；隨著時間的繼續(xù)推遲，愈傷組織上的芽點數(shù)增多，但由于叢芽的群體效應，有效芽形成率減少，且由于愈傷組織誘導時間過長，在轉入培養(yǎng)基2后，容易出現(xiàn)褐變，從而也影響有效再生芽的成活。

圖 4 愈傷組織不同切塊時間對不定芽增殖的影響

2.3 NAA濃度對愈傷組織不定芽增殖的影響

分析不同NAA濃度與6-BA的互作，以及對愈傷組織不定芽增殖效果的影響。表3結果表明，當6-BA濃度為2 mg·L-1時，以NAA濃度為0.2 mg·L-1時，分化成芽率最高為51.46%，其次為NAA濃度0.1 mg·L-1的40.18%，最低為NAA濃度0.3mg·L的36.96%。

表 1 NAA濃度對愈傷組織不定芽增殖的影響（mg·L-1、塊、%）

當6-BA與NAA比值增大，不定芽數(shù)和芽叢數(shù)先增加后減少，以NAA 0.2 mg·L-1為最佳濃度。隨著NAA濃度降低，有效芽數(shù)量降低；隨著NAA濃度提高，不定芽和叢芽數(shù)均降低，這說明，增加NAA濃度會削弱6-BA的細胞分裂作用，適量濃度的NAA可以獲得更多的有效芽，提供更多的有效芽來誘導形成小苗。

2.4 激素的加入方式對不定芽增殖的影響

植物激素高溫滅菌一般都是不能的，都會有損失，與培養(yǎng)基一起滅菌操作簡單、方便，但具體損失百分數(shù)不定，試驗設置滅菌前加激素、滅菌后加激素兩個處理，以不加植物激素為對照（圖5）。不定芽增殖培養(yǎng)基均為 MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，結果表明，兩種激素加入方式條件下，有效芽數(shù)和分化成芽率差異不顯著，分別為29、30塊和46.03%、46.88%，不加植物激素的CK卻不能形成有效芽，分化成芽率為15.00%，不定芽增殖的效率明顯低于兩個處理。這說明，一次性高壓濕熱滅菌，對6-BA和NAA的破壞程度較低，基本不影響對不定芽增殖，不過，要注意滅菌次數(shù)對培養(yǎng)基營養(yǎng)的影響。

圖 5 6-BA和NAA的加入時間對不定芽、有效芽形成與分化成芽率的影響

2.5 6-BA濃度對根誘導的影響

將2-3cm高的組培苗接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，并加入不同濃度的6-BA和IBA，15 d后觀察結果（表2）。結果表明，加入激素的各處理均能誘導組培苗長根，且根系較發(fā)達，未加入激素的對照，僅僅誘導1條根系，且細小、生命力弱且生根率低，當6-BA 0.10 mg·L-1和 IBA 0.5mg·L-1配比時，生根總數(shù)、生根率和平均長度數(shù)值最大，其次為6-BA 0.05 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1配比，二者無顯著差異；當6-BA 0.20 mg·L-1和 IBA 0.5 mg·L-1配比時，生根總數(shù)、生根率與平均長度均低于前兩者，且呈顯著差異。

表 2 不同的6-BA濃度對根系誘導的影響（mg·L-1、株、%）

3 討論

3.1 外植體消毒時間對消毒效果的影響

外植體大部分取自田間，表面上附著了大量病原微生物，消毒是組織培養(yǎng)一大障礙，組養(yǎng)前須進行消毒處理，把材料表面上的各種微生物殺滅，又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長，所以消毒時間長短對外植體的消毒效果十分關鍵。本試驗采用為10%的過氧化氫溶液，如果時間過長，就容易出現(xiàn)外植體壞死等問題，當消毒時間達8 min，可見外植體邊緣，特別是手術刀切割處變?yōu)樯詈稚绻^續(xù)延長時間，壞死范圍不斷擴大，影響外植體形成愈傷組織，以及愈傷組織分化形成叢芽的效率，所以在試驗過程中，要根據(jù)外植體自身情況，選擇合理的消毒時間。

3.2 組織培養(yǎng)中植物激素的配比與濃度配比

常用的植物激素有吲哚乙酸(IAA) 、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)和激動素(KT)， 其中誘導細胞分裂的有6-BA和KT，誘導細胞分化的有NAA、IAA和IBA，各激素的作用原理基本一致，作用效率也因對象而不同。本研究中，采用的是6-BA、NAA和IBA三種植物激素，分別探討了NAA濃度對芽的分化的影響，6-BA對根系分化的影響，并對愈傷組織不同切塊時間，以及植物激素加入方式等進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，當6-BA濃度為2 mg·L-1時，NAA 0.2 mg·L-1的處理對叢生芽的增殖和再生芽的誘導作用方面要優(yōu)于NAA 0.1 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1，這與謝慶華的 MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1結果一致[3]；當 IBA 濃度為 0.5 mg·L-1時，6-BA 0.10 mg·L-1對根系誘導的效果優(yōu)于 6-BA 0.05 mg·L-1、6-BA 0.20 mg·L-1。關于植物激素的濃度，許多研究使用了不同的濃度，卻能達到理想的效果，如朱生偉、徐仲等[11]研究中，誘導愈傷組織形成叢生芽的培養(yǎng)基配方為 2/3MS+BA0.5mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1，誘導根的培養(yǎng)基配方為 2/3MS+BA0.1mg·L-1+NAA1 mg·L-1；施和平、黃群聲等[8]采用的幼芽增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1，生根培養(yǎng)基配方為MS +NAA0.2 mg·L-1。這說明，植物激素的作用不僅僅為單方面作用的，而是表現(xiàn)在激素間的互作，在實踐過程中，需要進行不斷的嘗試，以取得最佳的試驗效果。

3.3 切塊時間與激素加入方式對組培效率的影響

關于烤煙組織培養(yǎng)的切塊時間和激素加入方式對組織培養(yǎng)效率的研究，至今鮮見報道，本研究彌補了研究的空白。在外植體叢生芽增殖階段，切塊時間的早晚，直接影響叢生芽的增殖，并與外植體褐變、污染等有一定關聯(lián)。本研究中，分別在叢芽形成后的10 d、15 d、20 d和25 d對外植體切塊，結果發(fā)現(xiàn)，切塊時間過早，叢芽增殖效率較低，有效芽數(shù)和分化成芽率較低；切塊時間過晚，體褐變數(shù)量最大，褐變率較高，有效芽數(shù)和分化成芽率也開始降低。研究結果發(fā)現(xiàn)，以15 d、20 d切塊外植體叢生芽增殖效果較好，褐變數(shù)量較少，增殖倍數(shù)理想，易于分割。同時，研究表明，一次性高壓濕熱滅菌，對6-BA和NAA活性影響不大，基本不影響不定芽增殖，但要注意滅菌次數(shù)對培養(yǎng)基營養(yǎng)的影響。

4 結論

外植體采用10%的過氧化氫溶液消毒時，消毒時間不應超過8 min，具體應根據(jù)外植體自身情況，選擇合理的消毒時間。

最佳愈傷組織誘導和不定芽分化的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，最佳生根培養(yǎng)基配方為 1/2MS+6-BA 0.10 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1。

叢芽形成后15 d、20 d切塊外植體叢生芽增殖效果較好，褐變數(shù)量較少，增殖倍數(shù)理想，易于分割。

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