羅非魚魚鱗明膠蛋白膜的制備及特性

吳菲菲，翁武銀，蘇文金，曹敏杰，劉光明

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

目前用于食品包裝的材料大部分為塑料制品，但塑料垃圾在自然界中不易分解腐爛，給生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的危害。而且在食品加工貯藏過程中，塑料中殘留的一些添加劑、增塑劑等可能會由包裝袋向內(nèi)裝食品遷移，給食品帶來安全隱患［1］。因此，國內(nèi)外眾多學者開始致力于可食性或可降解性包裝膜的研究，探尋可部分替代塑料包裝的材料，減少環(huán)境污染?？墒衬さ闹苽洹⑿阅芨牧技捌鋺醚芯勘砻?，利用蛋白質(zhì)制備的可食膜不僅具有良好的機械性能，而且氧氣阻隔性能也比多糖類可食膜和脂類可食膜優(yōu)越［2－3］。其中，明膠由于具有豐富的原料來源和良好的成膜性能，作為蛋白可食膜的制備原料日益受到重視。目前明膠的生產(chǎn)原料主要為豬、牛的皮和骨，但由于對瘋牛病、口蹄疫的恐慌以及宗教信仰等原因，研究人員開始嘗試利用水生動物資源的下腳料提取明膠制備可食膜。另一方面，近年來我國水產(chǎn)品加工業(yè)得到迅速發(fā)展，2010年加工總量已超過1600萬t，其中魚糜制品年產(chǎn)量接近100萬t，羅非魚年加工量達到60萬t左右［4］。在魚糜加工和冷凍魚片生產(chǎn)過程中，必然會產(chǎn)生大量的魚皮、魚鱗等下腳料。然而，這些下腳料目前主要被用于生產(chǎn)魚粉等低附加值產(chǎn)品，部分魚鱗甚至被作為廢棄物直接丟棄，不僅浪費資源，也給環(huán)境造成污染。雖然利用魚類下腳料中豐富的蛋白資源制備可食膜已引起廣泛的關注，但主要集中在魚皮明膠蛋白膜的研究上［5－8］，關于利用含鈣組織如魚鱗制備明膠蛋白膜的研究還鮮見報道。因此，本研究利用羅非魚魚鱗制備明膠蛋白可食膜，考察了魚鱗明膠的提取溫度與時間以及甘油的添加對明膠蛋白膜理化性質(zhì)的影響，探究魚鱗明膠的成膜性能，為魚鱗的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的羅非魚魚鱗 福建廈門同安源水水產(chǎn)食品有限公司;甘油 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉 廣東光華化學廠有限公司;鹽酸西隴化工股份有限公司;DC蛋白測定試劑盒 美國Bio－Rad公司;分子量標準物 美國Fermentas公司。

Avanti J－25高速冷凍離心機 美國Beckman公司;UM113型攪拌脫泡機 日本Unix有限公司;PSX智能型恒溫恒濕箱 浙江寧波萊福科技有限公司;厚度儀 日本Ozaki MFG公司;TMS－PRO質(zhì)構(gòu)儀 美國Food Technology公司;UV－2600A型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;WSC－S測色色差計 上海精密科學儀器有限公司;DSC－Q2000型 美國TA儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚鱗的前處理 新鮮的羅非魚魚鱗利用3倍原料重量的0.05mol/L NaOH－25%酒精－1.5%H2O2溶液浸漬24h后，用清水漂洗至中性，再加入3倍原料重量的0.05mol/L HCl溶液于室溫下攪拌浸漬2h，然后用清水漂洗至溶液的pH接近中性，瀝干后冷凍干燥，于－37℃冰箱中保存用作以下實驗的原料。

1.2.2 明膠蛋白的提取和組分分析 魚鱗明膠蛋白的提取參考Jongjareonrak等［8］報道的方法并做些許改動。精確稱取2g左右前處理過的魚鱗，加入50mL蒸餾水，利用熱水浴(60、80、100℃)浸提一段時間后，用冰水浴冷卻至室溫，通過離心(15000×g，20℃，15min)獲得明膠蛋白溶液。提取液中的明膠蛋白含量和魚鱗中的總蛋白含量根據(jù)凱氏定氮法［9］進行測定，魚鱗明膠蛋白的提取率為提取的明膠蛋白含量(g)占魚鱗中總蛋白含量(g)的比例。此外，明膠蛋白的分子量分布利用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)進行分析。

1.2.3 明膠蛋白膜的制備 明膠蛋白膜參考翁武銀等［10］報道的方法進行制備。將明膠蛋白溶液的濃度調(diào)配成2%(w/v)，并添加蛋白質(zhì)量20% (w/w)的甘油，利用攪拌脫泡機對其進行脫泡后，將制備的溶液(4g)倒在5cm×5cm的有機硅樹脂框內(nèi)，放在(25±1)℃、相對濕度(RH)50%±5%的恒溫恒濕箱中干燥24h后制備成明膠蛋白膜，揭膜后繼續(xù)放在恒溫恒濕箱中平衡48h，作為以下實驗的測試樣品。

另外，為了考察甘油對魚鱗明膠蛋白膜性質(zhì)的影響，在2%魚鱗明膠蛋白溶液中添加蛋白質(zhì)量20%～50%的甘油，然后按照上述方法制備成明膠蛋白膜。

1.2.4 機械性能的測定 將切成寬15mm、長45mm的明膠蛋白膜用厚度儀測定厚度后，利用質(zhì)構(gòu)儀對膜進行拉伸實驗，力量感應元為100N，初始間隔為30mm，拉伸速率為1mm/s。明膠膜的抗拉伸強度(TS)和斷裂伸長率(EAB)根據(jù)翁武銀等［10］報道的方法進行計算。

1.2.5 水蒸汽透過率的測定 明膠蛋白膜的水蒸汽透過率(WVP)參照ASTM提供的方法進行測定［11］。在瓶口內(nèi)徑為2.2cm、容積為50mL的PET瓶中加入約40g完全干燥的硅膠，用明膠蛋白膜封緊瓶口，然后將PET瓶置于溫度為30℃、RH為100%的玻璃干燥器中，每隔1h測定PET瓶的重量。膜的WVP根據(jù)翁武銀等［10］報道的方法按以下公式進行計算。

式中，t為測定時間(s)，w為t時間內(nèi)瓶重變化量(g)，x為膜的厚度(m)，A為瓶口表面積(m2)，ΔP為瓶內(nèi)外的水蒸汽壓差(Pa)。

1.2.6 顏色和透光率的測定 明膠蛋白膜的顏色利用色差計進行測定，膜的顏色以參數(shù)L*(黑－白)、a*(綠－紅)、b*(藍－黃)的值表示。膜的透光率和透明度值按照Hoque等［12］的方法進行測定，利用紫外分光光度計測定明膠膜在200～800nm波長范圍內(nèi)的透光率，膜的透明度值按以下公式進行計算:

式中，T600為膜在600nm波長下的透光率，x為膜的厚度(mm)，透明度值越高表示蛋白膜越不透明。

1.2.7 SDS－PAGE SDS－PAGE根據(jù)Laemmli［13］的方法進行測定，其中濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%和6%。提取的魚鱗明膠蛋白和制備的明膠蛋白膜利用8mol/L尿素－2%SDS－20mmol/L Tris－HCl (pH8.8)蛋白變性劑進行溶解后制備成蛋白濃度為1μg/μL的電泳樣品，每個泳道加入10μL的電泳樣品，在10mA下進行電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R－250染色液染色，再用脫色液(甲醇/乙酸/水為3/1/6，v/v/v)脫色至背景完全透明為止。

1.2.8 差示掃描量熱分析(DSC) 利用差示掃描量熱儀測定明膠膜的熱力學性質(zhì)，儀器采用金屬銦進行校正。明膠膜先用液氮研磨成粉末，并放置在硅膠干燥器中干燥一周，獲得的樣品用于DSC分析和水分含量測定。DSC分析時，準確稱取20mg左右上述樣品放入坩堝中，以Al2O3粉末作為參比，系統(tǒng)用液氮冷卻后，以10℃/min的升溫速率從－90℃開始升溫至200℃后快速降溫，在－90℃平衡后，再以10℃/min的升溫速率升溫至200℃，得到第二循環(huán)的DSC結(jié)果。利用DSC配套的數(shù)據(jù)處理軟件對DSC曲線進行分析，明膠膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)為轉(zhuǎn)變斜線的中點所對應的溫度。粉末樣品的水分含量利用常壓干燥法［14］進行測定。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)對所得數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，顯著性檢驗方法為Duncan多重檢驗，顯著水平為0.05［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提溫度與時間對明膠蛋白提取率的影響

圖1顯示了浸提溫度與時間對魚鱗明膠蛋白提取率的影響。由圖可知，浸提時間相同時，60℃下明膠蛋白的提取率最低，80℃次之，100℃最高，表明提高浸提溫度可以促進明膠蛋白從魚鱗中溶解出來。而且，不管在哪一個浸提溫度下，魚鱗明膠蛋白的提取率均隨浸提時間的延長逐漸增大，并在浸提時間超過4h后逐漸趨于平衡。膠原是由3條α肽鏈纏繞形成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，相對分子量大約為300ku［16］。在熱水作用下，維系膠原3股螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子內(nèi)/分子間氫鍵等次級鍵及部分肽鍵斷裂，膠原的β肽鏈、α肽鏈及其聚集體和降解組分溶解到水中［17］，而且提高溫度會促進膠原變性轉(zhuǎn)換成明膠，加速明膠蛋白的溶解。因此，魚鱗明膠蛋白提取率隨浸提溫度的升高和浸提時間的延長逐漸增加(圖1)。

圖1 浸提溫度與時間對羅非魚魚鱗明膠蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature and time on the extraction yield of gelatin from tilapia scales

2.2 浸提溫度與時間對明膠蛋白組分的影響

利用SDS－PAGE對不同溫度和時間提取的明膠蛋白進行分析，結(jié)果如圖2所示。利用60℃浸提時，加熱0.5h和1h提取的明膠蛋白中除了β肽鏈、α1肽鏈和α2肽鏈以外，還出現(xiàn)了兩條分子量分別為160、80ku左右的蛋白條帶。然而，隨著浸提時間的延長，α肽鏈及其以上的蛋白組分發(fā)生明顯的降解，分子量小于80ku的蛋白組分逐漸增多(圖2)，表明經(jīng)過前處理后魚鱗粗膠原蛋白中可能殘留一些蛋白酶，導致明膠蛋白在浸提過程中發(fā)生降解。Jongjareonrak等［8］也報道了大眼鯛魚皮中存在基質(zhì)金屬蛋白酶，添加胰蛋白酶抑制劑或EDTA能夠抑制明膠蛋白在60℃提取時發(fā)生降解。當浸提溫度提高至80℃時，加熱1h以內(nèi)提取的明膠蛋白中也會觀察到160ku和80ku左右的這兩條蛋白條帶，但與60℃提取時的相比，條帶濃度明顯減少。而浸提3h以上的明膠蛋白中未觀察到這些蛋白降解物，但β肽鏈和α肽鏈的條帶濃度卻出現(xiàn)一定程度的下降，同時小分子物質(zhì)(＜α2)逐漸增多(圖2)。這可能是在80℃水浴升溫過程中，殘留的蛋白酶導致明膠蛋白發(fā)生一定程度降解。當浸提時間超過3h后酶解產(chǎn)物和高分子組分(＞α2)由于熱分解作用而發(fā)生降解，但相對60℃提取的明膠其β肽鏈和α肽鏈的降解明顯受到抑制。而魚鱗在100℃下浸提0.5h時，得到的明膠蛋白中幾乎未發(fā)現(xiàn)160ku和80ku左右的蛋白降解物(圖2)，表明了魚鱗內(nèi)源性蛋白酶在100℃下易失活。但100℃卻促進了明膠在高溫下的熱分解，當浸提時間達到3h以上時，β肽鏈和α肽鏈的條帶基本上在電泳圖譜中消失(圖2)。以上結(jié)果表明，80℃水浴最適合用于提取羅非魚魚鱗明膠蛋白，得到的明膠蛋白中β肽鏈和α肽鏈組分被分解的程度最小。

圖2 浸提溫度與時間對羅非魚魚鱗明膠蛋白組分的影響Fig.2 Effect of extraction temperature and time on the protein patterns of tilapia scale gelatin

2.3 提取工藝對明膠蛋白膜性質(zhì)的影響

2.3.1 浸提溫度對蛋白膜性質(zhì)的影響 為了考察浸提溫度對魚鱗明膠蛋白膜機械性能和阻濕性能的影響，利用蛋白組分較接近(浸提0.5h，圖2)的明膠蛋白作為原料制備可食膜，并對其機械性能和水蒸汽透過性能進行測定(表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以80℃提取的明膠蛋白為原料制備的可食膜其抗拉伸強度(TS)最高，100℃次之，60℃最低。通常，明膠蛋白膜的機械性能與成膜明膠蛋白的分子量分布相關，高分子量成分含量越多，膜的TS越高［8］。在80℃和100℃下提取的明膠蛋白中不僅含有大量的β肽鏈和α肽鏈，還含有一些分子量大于β肽鏈的高分子多聚體，而60℃浸提的明膠蛋白中分子量低于α肽鏈的蛋白降解組分明顯較多(圖2)，因此利用80℃和100℃浸提的明膠可以獲得具有較高機械強度的蛋白膜(表1)。另一方面，提高明膠蛋白的浸提溫度，魚鱗明膠蛋白膜的EAB隨之增加(表1)。這可能是隨著浸提溫度的升高，明膠蛋白充分受熱變性，分子鏈逐漸展開，在成膜過程中能夠有效地纏繞，從而使形成的明膠蛋白膜具有更好的延展性和柔韌性，宏觀上表現(xiàn)為膜的EAB值增大。

表1 浸提溫度對魚鱗明膠蛋白膜的抗拉伸強度(TS)、斷裂延伸率(EAB)和水蒸汽透過率(WVP)的影響Table 1 Effect of extraction temperature on the tensile strength(TS)，elongation at break(EAB)and water vapor permeability(WVP)of edible films based on tilapia scale gelatin

表1還顯示了利用不同溫度提取的明膠制備的蛋白膜其水蒸汽透過率(WVP)的測定結(jié)果。由表可知，魚鱗明膠蛋白膜的WVP值為1.12～1.46×10－10g· m－1·s－1·Pa－1，80℃提取制備的蛋白膜其WVP略高于60℃與100℃。主要原因是:60℃提取的明膠蛋白中小分子蛋白降解物較多(圖2)，在成膜過程中這些小分子物質(zhì)填充到膜網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的孔隙中，從而增強了膜阻礙水分子穿透的能力;而明膠蛋白分子在100℃下得到充分伸展，形成的蛋白膜的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更為緊密，導致膜的WVP值較低。

2.3.2 浸提時間對蛋白膜性質(zhì)的影響 由于80℃浸提的明膠蛋白成膜性能最好(表1)，因此以80℃為浸提溫度，考察了浸提時間對魚鱗明膠蛋白膜機械性能和阻濕性能的影響，結(jié)果列于表2中。當魚鱗明膠蛋白提取時間較短時(＜1h)，以其為原料制備的蛋白膜的TS值最大，并且高于藍鯨魚皮明膠蛋白膜(27.29MPa)［5］和大眼鯛魚皮明膠蛋白膜(28.28MPa)［8］，類似于紅鯛魚皮明膠蛋白膜(41.09MPa)［8］。然而，進一步延長浸提時間，明膠蛋白膜的TS明顯下降(表2)，表明了在80℃下短時間浸提的羅非魚魚鱗明膠蛋白具有較好的成膜性能。當浸提時間達到3h以上時，明膠蛋白發(fā)生熱分解(圖2)，導致形成的魚鱗明膠蛋白膜的TS下降(表2)。另一方面，魚鱗明膠蛋白膜的EAB和WVP隨浸提時間的延長分別呈上升和下降趨勢(表2)，進一步表明了充分受熱的明膠蛋白容易形成EAB高而WVP低的蛋白膜。

表2 浸提時間對魚鱗明膠蛋白膜的抗拉伸強度(TS)、斷裂延伸率(EAB)和水蒸汽透過率(WVP)的影響Table 2 Effect of extraction time on TS，EAB and WVP of edible films based on tilapia scale gelatin

根據(jù)圖1、圖2和表1、表2的結(jié)果可知，利用80℃加熱1h提取羅非魚魚鱗明膠，不僅可以獲得較高的蛋白提取率，而且得到的明膠蛋白具有良好的成膜性能，因此，利用80℃浸提1h的明膠為原料，詳細考察甘油添加量對魚鱗明膠蛋白膜性質(zhì)的影響。

2.4 甘油添加量對魚鱗明膠蛋白膜性質(zhì)的影響

2.4.1 甘油添加量對明膠膜機械性能與阻濕性能的影響 表3顯示了甘油添加量對魚鱗明膠蛋白膜TS、EAB和WVP的影響。隨著甘油添加量的增加，明膠蛋白膜的TS逐漸下降，EAB逐漸上升(表3)。甘油是親水性小分子，容易進入到明膠蛋白分子鏈之間并與明膠蛋白分子中的親水基團形成氫鍵，從而使得明膠蛋白分子間的相互作用力減弱，結(jié)果導致膜的脆性降低，柔韌性增強。然而，即使當甘油添加量增加到蛋白含量的50%時，本研究制備的魚鱗明膠蛋白膜的TS還可達到16.45MPa，與塑料包裝低密度聚乙烯膜的抗拉伸強度(16.5MPa)類似［18］，進一步表明利用羅非魚魚鱗提取的明膠蛋白具有良好的成膜性能。另一方面，由于甘油的親水特性，其含量增多會使明膠蛋白膜的吸濕性增強，WVP值上升(表3)。表 3中的結(jié)果表明，甘油添加量較低(20%)時，明膠蛋白膜可獲得較好的抗拉伸性能及阻濕性能，但提高甘油含量卻可以改善明膠蛋白膜的柔韌性。因此，可以根據(jù)實際需要改變甘油添加量以擴大明膠蛋白膜的應用范圍。

表3 甘油添加量對蛋白膜的抗拉伸強度(TS)、斷裂延伸率(EAB)和水蒸汽透過率(WVP)的影響Table 3 Effect of glycerol content on TS，EAB and WVP of gelatin films prepared from tilapia sclaes

2.4.2 甘油添加量對明膠膜顏色和透明度的影響 甘油對魚鱗明膠膜顏色及透光性能的影響如表4所示。由表可知，改變甘油添加量，明膠膜的L*、a*、b*值未發(fā)生明顯的變化，且均與白板的參數(shù)值(L*=91.86，a*=－0.88，b*=1.42)接近，表明利用羅非魚魚鱗制備的明膠蛋白膜在外觀上幾乎無色，而且甘油對明膠蛋白膜的顏色沒有顯著影響。另一方面，明膠蛋白膜的透明度值隨甘油含量的增加逐漸降低，表明甘油的添加增強了蛋白膜的透光性能?？赡苁歉视妥鳛樾》肿釉鏊軇┤菀走M入明膠蛋白分子之間，導致單位面積內(nèi)蛋白分子數(shù)目相對減少，使光線容易透過，因此提高了明膠蛋白膜的透光性能。姜燕等［19］也報道了甘油比其他增塑劑更容易增強蛋白膜的透光性能。

表4 甘油添加量對魚鱗明膠蛋白膜顏色和透明度的影響Table 4 Effect of glycerol content on the color and transparency value of gelatin films prepared from tilapia scales

2.4.3 甘油對明膠膜蛋白組分的影響 甘油添加量對魚鱗明膠膜蛋白組分的影響如圖3所示。成膜溶液和明膠膜的主要蛋白組分均與明膠原料(80℃，1h;圖2)一致，甘油的添加沒有使成膜溶液和明膠膜中的蛋白組分發(fā)生明顯的變化(圖3)?？赡苁怯捎诟视驮诔赡み^程中通過與明膠蛋白分子形成鏈間氫鍵而起到增塑作用，而氫鍵在制備電泳樣品時容易被破壞，因此無法在SDS－PAGE圖譜中體現(xiàn)。甘油對藍鯨魚皮明膠膜蛋白組分的影響也顯示了與本文類似的結(jié)果［5］。然而，在圖3中卻觀察到明膠蛋白膜中β肽鏈和α肽鏈的條帶濃度明顯低于成膜溶液，而160ku和80ku處的酶解產(chǎn)物含量明顯增多，可能是經(jīng)80℃加熱1h未完全失活的蛋白酶在成膜過程(RH=50%，25℃干燥)中導致明膠蛋白發(fā)生了進一步的降解。

圖3 甘油對明膠蛋白膜蛋白組分的影響Fig.3 Protein patterns of tilapia scale gelatin films with different glycerol concentration

2.4.4 甘油對明膠膜熱穩(wěn)定性的影響 圖4顯示了不同甘油添加量的魚鱗明膠蛋白膜的DSC曲線和水分含量的測定結(jié)果。由圖可知，當甘油添加量為20%時，魚鱗明膠蛋白膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)可達113.97℃，高于甘油添加量為25%的大眼鯛魚皮明膠膜(Tg=72.97℃)［8］和紅鯛魚皮明膠膜(Tg= 91.58℃)［8］，與相同甘油添加量的牛皮明膠膜(Tg= 111.0℃)［20］相當，表明羅非魚魚鱗制備的明膠蛋白膜具有與牛皮明膠膜類似的熱穩(wěn)定性。從圖4還可獲知魚鱗明膠蛋白膜的Tg隨甘油含量的增加逐漸降低，這一結(jié)果與甘油對豬皮明膠膜熱穩(wěn)定性影響的報道一致［21］。甘油作為親水性增塑劑，與明膠蛋白分子鏈上的親水基團形成氫鍵，從而使得相鄰大分子間的作用力減弱，膜網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低。此外，由于甘油的親水特性，提高甘油添加量使得明膠蛋白膜中水分含量明顯增多(圖4)。而水分子在蛋白膜中同樣可以起到增塑劑的作用［22］，水分含量的增加進一步削弱了明膠蛋白分子間的相互作用。因此，魚鱗明膠膜的熱穩(wěn)定性隨甘油含量的增加逐漸下降(圖4)，結(jié)果導致膜的TS也隨之降低(表3)。

3 結(jié)論

利用熱水浸提法提取羅非魚魚鱗明膠蛋白時，發(fā)現(xiàn)隨著浸提溫度的增加和浸提時間的延長，從魚鱗中溶解出來的明膠蛋白含量逐漸增多，80℃浸提時明膠蛋白的降解程度最小。而且，利用80℃浸提1h的明膠可制備成無色透明、具有良好機械性能的蛋白膜，表明羅非魚魚鱗明膠可以作為制備蛋白可食膜的新型替代原料。另一方面，甘油在魚鱗明膠蛋白膜中主要起增塑劑的作用，其添加量的增加會逐漸減弱明膠蛋白分子之間的相互作用力，導致膜的熱穩(wěn)定性和機械性能下降，但膜的柔軟性卻可以得到改善。因此，通過調(diào)整甘油添加量可以制備出機械強度和柔韌性符合實際需求的蛋白膜。

圖4 魚鱗明膠蛋白膜的DSC曲線和水分含量Fig.4 DSC thermograms and water content of tilapia scale gelatin films

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