利用人體外周血痕sjTREC含量推斷個(gè)體年齡

曲冬陽(yáng)，鄧淑嬌，葛蕓英，陳松，歐雪玲

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證教研室，廣東廣州 510080；2.廣州市公安局白云區(qū)分局，廣東廣州 510420；3.公安部物證鑒定中心法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038）

利用人體外周血痕sjTREC含量推斷個(gè)體年齡

曲冬陽(yáng)1，鄧淑嬌2，葛蕓英3，陳松3，歐雪玲1

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證教研室，廣東廣州 510080；2.廣州市公安局白云區(qū)分局，廣東廣州 510420；3.公安部物證鑒定中心法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038）

目的 驗(yàn)證人外周血中信號(hào)結(jié)合T細(xì)胞受體刪除DNA環(huán)（signal joint T-cell receptor excision DNA circle，sjTREC）水平與年齡的相關(guān)性公式，探討其在鑒定實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。方法收集已知年齡的健康無(wú)關(guān)個(gè)體外周血痕樣品30例，室溫放置4周后，分別提取血痕DNA。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，定量測(cè)定外周血痕DNA中sjTREC含量，并選擇人TATA盒結(jié)合蛋白（TATA box binding protein，TBP）序列作為內(nèi)參基因。采用年齡推斷公式Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC）推算血痕的供體年齡，并與供體實(shí)際年齡作比較，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性。結(jié)果在收集的30例血痕樣品中均能檢測(cè)到目的基因sjTREC和內(nèi)參基因TBP。外周血痕sjTREC含量隨供體年齡的增長(zhǎng)而降低（P＜0.01）。采用本方法推斷血痕個(gè)體年齡的準(zhǔn)確率為76.67%。結(jié)論利用sjTREC含量推斷血痕個(gè)體年齡的方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、種屬特異性好，具有重要的應(yīng)用前景。

法醫(yī)遺傳學(xué)；血液；信號(hào)結(jié)合T細(xì)胞受體刪除DNA環(huán)；年齡

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，個(gè)體年齡是一個(gè)非常重要的表型特征。當(dāng)生物學(xué)檢材如外周血標(biāo)本等不具備形態(tài)學(xué)信息時(shí)，根據(jù)分子生物學(xué)的方法可得到與年齡相關(guān)的一些有效信息。信號(hào)結(jié)合T細(xì)胞受體刪除DNA環(huán)（signal joint T-cell receptor excision DNA circle，sjTREC）產(chǎn)生于T細(xì)胞發(fā)育早期T細(xì)胞受體α（T cell receptor α，TCRα）基因重排過(guò)程中，其作用是作為初始T細(xì)胞的標(biāo)志而反映胸腺的近期輸出功能。本研究前期實(shí)驗(yàn)[1]已表明，人體外周血sjTREC含量隨個(gè)體年齡的增長(zhǎng)而降低，并同時(shí)對(duì)264例0～86歲健康無(wú)關(guān)個(gè)體的新鮮血痕作sjTREC定量分析，歸納出年齡推斷的回歸方程為Age=-7.181 5 Y-42.458±9.42（Y= dCtTBP-sjTREC）。然而，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，現(xiàn)場(chǎng)除了新鮮血痕外，陳舊血痕也并不少見。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)30例在室溫下放置4周的正常人外周血痕中sjTREC水平做定量分析，從而模擬陳舊血痕，觀察其與個(gè)體年齡的相關(guān)性；并利用上述已推導(dǎo)出的回歸方程推斷其年齡，通過(guò)與樣本實(shí)際年齡對(duì)比，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性以探討其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 引物和探針設(shè)計(jì)

在TCRδ基因組序列（ACCESSION：AE000521）中于δRec基因片段的下游設(shè)計(jì)1段下游引物（P1：5′-CCATGCTGACACCTCTGGTT-3′），在ψJα的上游設(shè)計(jì)1段上游引物（P2：5′-TCGTGAGAACGGTGAATG AAG-3′），引物的方向與一般的PCR引物相反。由于在δRec和ψJα兩個(gè)基因片段刪除重組形成一環(huán)形DNA，其方向與原方向相反（圖1），當(dāng)形成DNA環(huán)，才能擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，即sjTREC特異PCR引物設(shè)計(jì)的原理。同時(shí)在該擴(kuò)增片段中間設(shè)計(jì)1段Taqman熒光素標(biāo)記探針（T1：5′-FAM-CACGGTGATGCATAG GCACCTGC-TAmRA-3′）。作為細(xì)胞定量對(duì)照，選擇人TATA盒結(jié)合蛋白（TATA box binding protein，TBP）基因作對(duì)照：分別在TBP基因組序列（ACCESSION：NG008165）中設(shè)計(jì)一對(duì)引物（P3：5′-TTAGCTGGCTCT GAGTATGAATAAC-3′和P4：5′-AACCAATAAAACC TACTCCTCCCTTAA-3′）及1段Taqman熒光素標(biāo)記探針（T2：5′-FAM-CAGTCCAGACTGGCAGCAAGAA AAT-TAMRA-3′）。

圖1 sjTREC特異PCR引物設(shè)計(jì)原理

1.2 人外周血痕樣本的制備

收集30例人外周血痕樣本，入選者年齡為0.3（4個(gè)月）～78歲的健康志愿者，其中男性16例，女性14例。經(jīng)體檢，入選者外周血常規(guī)均正常。征得同意后，采集外周靜脈血1mL，經(jīng)EDTA-K2抗凝處理后，取300μL滴加于消毒的干凈濾紙上，室溫晾干后繼續(xù)放置4周，采用E.Z.N.A.?Forensic DNA Kit（美國(guó)Omega公司）提取血痕DNA，DNA樣本編號(hào)（1～30）后放于-20℃冰箱凍存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

PCR反應(yīng)體積20 μL，包括：2×Premix Ex TaqTM10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探針0.5μL，DNA模板4μL，其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃32s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 檢測(cè)樣本中sjTREC含量

使用以上實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)上述30例人外周血痕樣本中sjTREC的含量進(jìn)行定量檢測(cè)。每一樣本分別進(jìn)行3次sjTREC和3次TBP的檢測(cè)，并分別計(jì)算sjTREC和TBP基因的平均Ct值，sjTREC含量以ΔCt值=平均CtTBP-平均CtsjTREC表示。

1.5 靈敏度和種屬特異性檢測(cè)

選取7號(hào)（年齡＜30歲）、30號(hào)（年齡＞70歲）DNA樣本，分別用Gene Quant pro紫外分光光度儀（瑞典Amersham Pharmacia公司）定量后用滅菌水稀釋為5、10、25、50、75、100、125ng/μL，用上述方法進(jìn)行sjTREC的檢測(cè)，驗(yàn)證本方法的靈敏度。同時(shí)采集狗、豬、牛、魚、雞的血痕樣本，用上述方法進(jìn)行血痕DNA的提取和sjTREC含量檢測(cè)，驗(yàn)證方法的種屬特異性。

1.6 方法驗(yàn)證

對(duì)上述30例人外周血痕樣本進(jìn)行方法驗(yàn)證，利用已推導(dǎo)出的回歸方程Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC），其中±9.42歲為該公式在推斷個(gè)體年齡中的標(biāo)準(zhǔn)差，在此標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)判定為準(zhǔn)確[1]，以此來(lái)推斷血痕的供體年齡，通過(guò)與樣本實(shí)際年齡對(duì)比，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果

2.1 外周血痕sjTREC水平的測(cè)定結(jié)果

30例供體血痕的基因組DNA經(jīng)實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增后，均可見清晰的擴(kuò)增曲線；由圖2可見，外周血痕sjTREC含量（ΔCt值）隨供體年齡的增加而降低（P＜0.01）。

圖2 ΔCt值與年齡相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.2 靈敏度和種屬特異性檢測(cè)結(jié)果

靈敏度：對(duì)7號(hào)、30號(hào)不同供體年齡血痕DNA的sjTREC檢測(cè)顯示，當(dāng)血痕供體年齡為27歲時(shí)（7號(hào)樣本），起始DNA模板量≥10 ng可得到穩(wěn)定且理想的sjTREC擴(kuò)增曲線圖；當(dāng)血痕供體年齡為78歲時(shí)（30號(hào)樣本），起始DNA模板量≥100ng可得到穩(wěn)定的擴(kuò)增曲線圖。因此，當(dāng)血痕供體年齡不明確時(shí)，應(yīng)使用的血痕最低模板DNA量為100ng。

種屬特異性：采用本方法對(duì)狗、豬、牛、魚、雞等動(dòng)物DNA樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，均未獲得擴(kuò)增結(jié)果。

2.3 血痕的供體年齡推斷

據(jù)方程Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC），將以上30例外周血痕DNA樣本的ΔCt值分別代入年齡推斷方程，可獲得血痕供體的推斷年齡，各血痕供體的實(shí)際與推斷供體年齡結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，使用該公式對(duì)30例血痕樣本進(jìn)行供體年齡推斷，有23例的供體年齡推斷與實(shí)際年齡差值小于9.42歲，準(zhǔn)確率為76.67%。

表1 30例血痕樣本推測(cè)年齡結(jié)果（歲）

3 討論

目前，應(yīng)用于血痕年齡推斷研究的分子生物學(xué)標(biāo)記主要包括端粒DNA限制性酶切片段長(zhǎng)度[2]、線粒體DNA 4977bp片段缺失程度[3]、DNA甲基化水平[4]等，均與個(gè)體年齡及衰老密切相關(guān)，但都有各自的局限。測(cè)量端粒DNA長(zhǎng)度對(duì)DNA的完整性要求高，血液樣本的需要量較大；線粒體DNA測(cè)量主要適用于20歲以上個(gè)體的年齡推測(cè)，在極高齡老人和有心臟病或其他病患的人群中使用線粒體DNA推測(cè)年齡并不可靠[5]；DNA甲基化研究仍處于初級(jí)階段，尚無(wú)成熟的數(shù)量關(guān)系理論[6]。鑒于此，國(guó)際法醫(yī)年齡推斷學(xué)會(huì)（Study Group on Forensic Age Diagnostics）提出，使用分子生物學(xué)方法推斷生物檢材的個(gè)體年齡時(shí)，應(yīng)盡可能使用多種不同的生物指標(biāo)，以提高年齡推斷的準(zhǔn)確性[7]。因此，尋找更多與個(gè)體年齡緊密相關(guān)的新指標(biāo)，建立推廣性強(qiáng)的檢測(cè)方法，將能對(duì)現(xiàn)有的生物檢材個(gè)體年齡推斷方法作有益的補(bǔ)充，從而提高年齡推斷的準(zhǔn)確性。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)30例在室溫放置4周的正常人外周血痕ΔCt值做定量分析。結(jié)果顯示，30例供體年齡為0.3（4個(gè)月）～78歲的外周血痕均能檢測(cè)到sjTREC基因，表明本法的年齡適用范圍廣；外周血痕ΔCt值隨供體年齡的增加而降低（P＜0.01），與前期研究結(jié)果[1]基本一致；當(dāng)血痕供體年齡不明確時(shí)，最低模板DNA量為100 ng，靈敏度較高，并具有較好的人類種屬特異性。利用前期基于新鮮血痕研究所建立的年齡推斷公式Age=-7.181 5 Y-42.458±9.42（Y= dCtTBP-sjTREC）推斷30例血痕供體年齡，其中有23例與實(shí)際年齡的差值小于9.42歲，準(zhǔn)確率為76.67%，表明該公式也適用于放置4周內(nèi)的血痕樣本供體年齡推斷。在進(jìn)一步的研究中，可通過(guò)結(jié)合其他與年齡相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，包括端粒DNA限制性酶切片段長(zhǎng)度、線粒體DNA 4977bp片段缺失程度、DNA甲基化水平等，考察溫度、濕度、光照等環(huán)境因素對(duì)sjTREC含量的影響，以提高血痕供體年齡推斷的準(zhǔn)確性。

此外，本研究使用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、速度快，在法醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中具有一定的應(yīng)用前景。

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Age Estimation Using Content of sjTREC in Human Peripheral Blood

QU Dong-yang1,DENG Shu-jiao2,GE Yun-ying3,CHEN Song3,OU Xue-ling1
（1.Faculty of Forensic Medicine,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Baiyun District Sub-bureau,Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510420, China;3.Key Laboratory of Forensic Genetics,Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security, Beijing 100038,China）

ObjectiveTo determine and verify the correlation formula of age estimation using the content of signal joint T-cell receptor excision DNA circle（sjTREC）in human peripheral blood and to discuss its application value in forensic biological practice.MethodsThe samples of peripheral blood stains were collected from 30 healthy unrelated individuals whose ages were known.The DNAs were extracted from the samples stored at room temperature after 4 weeks.The content of sjTREC was measured by real-time fluorescent quantitative PCR technique,and the TATA box binding protein（TBP）was selected as reference genes.The age of each sample was predicted with the formula which was Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC）,and the result was compared with the real age of each individual to determine the accuracy of the formula.ResultssjTREC and TBP gene were detectable in all 30 samples of peripheral blood.The contents of sjTREC in human peripheral blood showed a decreasing tendency with aging.The accuracy rate for the age estimation by this method was 76.67%.ConclusionThe method for the age estimation with the content of sjTREC was simple,fast,sensitive,and good species specific with important potential application prospect.

forensic genetics;blood;signal joint T-cell receptor excision DNA circle;age

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.005

1004-5619（2013）04-0256-03

2013-06-03）

（本文編輯：李成濤）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001352）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2011JB007）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)中山大學(xué)青年教師培育計(jì)劃項(xiàng)目（12ykpy04）

曲冬陽(yáng)（1988—），男，碩士研究生，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：qudongyang1988@hotmail.com

葛蕓英，女，碩士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：easygyy@yahoo.com.cn