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    ADMA/DDAH 通路在腦缺血再灌注致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用

    2013-03-11 08:19:50吳云虎王殿華
    關(guān)鍵詞:腦缺血內(nèi)皮細(xì)胞灰度

    吳云虎,王殿華

    ADMA/DDAH 通路在腦缺血-再灌注機(jī)制中研究較多,但在腦缺血-再灌注致肺損傷中對(duì)PMVECs通透性的作用機(jī)制仍未見(jiàn)有報(bào)道。本研究探討ADMA/DDAH 通路調(diào)控PKCα 和MCK 蛋白表達(dá)對(duì)PMVEC 的影響,進(jìn)一步揭示ADMA/DDAH 通路在腦I/R 致ALI 中的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌雄各半SD 大鼠36只,每體重200~260g,購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑:ADMA 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司;MTT 試劑購(gòu)自Biomol 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司;2×Taq PCR MasterMix 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;RIPA 裂解液、PKC 和MLCK 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司;RT-PCR試劑盒,批號(hào):9440-94A。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 參照Z(yǔ)ea-Longa 改良線(xiàn)栓法制作大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO);參照Z(yǔ)ea-Longa 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MCAO 進(jìn)行評(píng)分。

    1.2.2 腦缺血再灌注損傷大鼠血清的采集各組大鼠按設(shè)定處死時(shí)間,以氯胺酮麻醉后頸動(dòng)脈置管,取1.0ml 血置于檸檬酸抗凝管搖勻,3000 轉(zhuǎn)/min 離心,留取上清。分為滅活血清組和非滅活血清組處理:選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè),對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入與血清等體積的水,調(diào)節(jié)水浴箱溫度控制鈕,使溫度保持在56℃,定時(shí)30min 進(jìn)行血清滅活,滅活后-20℃~-70℃保存。

    1.2.3 大鼠PMVECs 的培養(yǎng) 取體健康雄性Wistar 大鼠1 只,麻醉固定后,取出肺臟至DMEM 培養(yǎng)液中,切割至約1mm3大小的組織塊,均勻放置在25ml 培養(yǎng)瓶中,靜置培養(yǎng)60h 后去除組織塊,于80%~90%細(xì)胞單層匯合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化后1∶2 傳代。

    1.2.4 細(xì)胞傳代 當(dāng)EC 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右傳代,用D-Hank’s:液漂洗3 次,加0.25%胰養(yǎng)蛋白酶1ml 于瓶中,使細(xì)胞充分接觸消化液,用吸管吹打細(xì)胞懸液,將此瓶細(xì)胞懸液分成二份加入新瓶中,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。以下實(shí)驗(yàn)采用2~5 代細(xì)胞進(jìn)行。

    1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠PMVECs 放在100ml 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),待80%單層匯合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為5 組:正常細(xì)胞組、正常滅活血清組、正常非滅活血清組、模型滅活血清組、模型非滅活血清組、ADMA 干預(yù)組和DDAH 抑制劑干預(yù)組。以上各組在培養(yǎng)箱中孵育4h,檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

    1.2.6 RT-PCR 法檢測(cè)PKC 和MLCK mRNA的表達(dá) 按Trizol 法提取總mRAN,按照一步法RTPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,獲得目的基因DNA 片段。引物序列:上游引物 5’-TGTCCAAAACCTACCCCACCATAT-3’,下游引物5’-CCCTTCTTACATCAGCCCTACTG-3’,擴(kuò)增片段為73bp 大小(引物合成由日本TaKaRa 公司合成)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,Gel-Doc 紫外凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算各條帶的灰度值。

    1.2.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞PKC 和MLCK 的表達(dá) 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度近80%時(shí),oxLDL 刺激6h 后加不同試劑,培養(yǎng)40min 檢測(cè)信號(hào)蛋白表達(dá),12h 后檢測(cè)PKCα 和MLCK 表達(dá),用PBS(pH7.4)洗3 遍,加入0.5ml RIPA buffer,用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來(lái),放到1.5ml 的EP 管中,冰上放置30min;在超速冷凍離心機(jī)中14000rpm 離心20min,保留上清;用Lorry 法對(duì)不同的細(xì)胞裂解產(chǎn)物定量其總蛋白濃度;按1∶1的比例加入2×蛋白上樣緩沖液,沸水煮5min;SDSPAGE 電泳125g/L 使用聚丙烯酰胺凝膠。封閉液在室溫下封閉1h,加入抗myc 抗體4℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 抗體形成免疫復(fù)合物,DAB 顯色后攝像。

    1.2.8 MTT 法細(xì)胞增殖/抑制活性測(cè)定 取經(jīng)不同濃度處理24h 的細(xì)胞孔,加入體積分?jǐn)?shù)為0.05g/L MTT 10μl/孔繼續(xù)培養(yǎng)4h,取板,吸盡上清,各孔加DMSO 100μl,室溫避光震蕩10min,讀取A492 值(OD)/孔。依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,對(duì)各干預(yù)組測(cè)定3 個(gè)平行孔A490 值(OD),細(xì)胞增殖率(%)=[實(shí)驗(yàn)組490A 值(OD)/正常對(duì)照組490A 值(OD)]×100%,其結(jié)果均以增殖指數(shù)>100% 表示細(xì)胞刺激增殖作用。同樣方法測(cè)定A570 值(OD)。

    2 結(jié)果

    2.1 PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與其余3 組比較,模型滅活血清組、模型非滅活血清組和ADMA 組PMVEC 中PKCα 和MLCK 蛋白水平明顯升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余3 組之間PKCα 和MLCK 蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1、圖1)。

    2.2 PMVEC 中PKCα、MLCK mRNA 的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與其余3 組比較,模型滅活血清組、模型非滅活血清組和ADMA 組PMVEC 中PKCα、MLCK mRNA 表達(dá)明顯升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余3 組之間PKCα 和MLCK 蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2、圖2)。

    2.3 PMVEC 細(xì)胞增殖活性 與其余4 組OD值(λ=490 波長(zhǎng))比較,模型滅活血清組和ADMA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞代謝活力顯著降低;與ADMA 組相比較,DDAH 組OD 值顯著增高,細(xì)胞代謝活力顯著增強(qiáng)(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)。

    表1 PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白表達(dá)灰度值(±s)

    表1 PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白表達(dá)灰度值(±s)

    與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P<0.05

    表2 PMVEC 中PKC、MLCK mRNA 表達(dá)灰度值(±s)

    表2 PMVEC 中PKC、MLCK mRNA 表達(dá)灰度值(±s)

    與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P<0.05

    表3 各組的細(xì)胞增殖(±s)

    表3 各組的細(xì)胞增殖(±s)

    與其余4 組比較* P<0.01

    圖1 腦I/R 損傷致ALI 細(xì)胞模型中PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白表達(dá)。與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P<0.05

    圖2 腦I/R 損傷致ALI 細(xì)胞模型中PMVEC 中PKCα、MLCK mRNA 表達(dá)。與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P<0.05

    3 討論

    新近研究證實(shí)[1,2]ADMA/DDAH 通路在體內(nèi)多個(gè)器官的細(xì)胞中存在,該通路參與多種生理和病理過(guò)程,在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

    ADMA 在蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methytransferases,PRMT)作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylme-thionine,SAM)為甲基供體,使各種多肽中的L-精氨酸殘基甲基化,甲基化的蛋白質(zhì)水解以后產(chǎn)生。ADMA 的主要降解及排泄系統(tǒng)是在二甲基精氨酸二甲氨水解酶(dimethylargininedimethy laminohydrolase,DDAH)作用下分解為瓜氨酸和二甲胺經(jīng)腎臟排出,所以PRMT 及DDAH 控制著ADMA 在體內(nèi)的濃度,ADMA 的代謝途徑即ADMA/DDAH 通路[3,4]。研究發(fā)現(xiàn),有多種細(xì)胞能生成ADMA,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞,健康人血漿中ADMA 的濃度為(1.15±0.13)μmol/L,內(nèi)皮細(xì)胞中的精確濃度尚未得知,但細(xì)胞內(nèi)ADMA 的濃度大約是培養(yǎng)液中的8~12 倍[5,6]。

    ADMA 是內(nèi)源性NOS 抑制劑。大量的研究證實(shí)ADMA 能競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS,阻止NO 合成,增加氧自由基的生成和引發(fā)血管炎癥。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)ADMA 聚集是內(nèi)皮功能不全的一個(gè)重要原因,其增高預(yù)示心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)和死亡率增高[7]。DDAH 的表達(dá)增強(qiáng)可以起到抑制ADMA 生成的作用,使用維甲酸上調(diào)DDAH 表達(dá)可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞ADMA 表達(dá)減少,含量下降,NO 合成增加。因此,DDAH 是一種比較理想的血管保護(hù)因子,ADMA/DDAH 通路可能在氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)皮保護(hù)作用之間產(chǎn)生有意義的影響,合理調(diào)整DDAH 含量,增強(qiáng)其表達(dá),抑制ADMA 含量的增加,降低其表達(dá),可以對(duì)缺血再灌注損傷起到很好的保護(hù)作用[8,9]。

    PKC 的持續(xù)高表達(dá)和異常激活是導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的最主要原因。PKC 激活后對(duì)肌動(dòng)蛋白肌絲相關(guān)蛋白進(jìn)行磷酸化,并能夠使肌球蛋白ATP 酶活性增加,從而使肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互結(jié)合維持持續(xù)的肌絲的收縮[10];PKCα 亦可參與促進(jìn)絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)的激活過(guò)程,而MAPK 的激活在維持平滑肌的持續(xù)收縮和膠原纖維增生中起重要作用[11];另外,PKCα 還可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸激酶(PTK)Rho 蛋白的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)肌絲的收縮[12];MLCK 介導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害,導(dǎo)致通透性增加,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙的形成和屏障功能障礙[13]。

    經(jīng)ADMA 干預(yù)后,MLCK 的蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),提示ADMA 可以增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性,導(dǎo)致MLCK 活性不斷升高,MLCK 催化MLC 磷酸化程度加大,導(dǎo)致EC 的向心性收縮增強(qiáng),細(xì)胞間隙形成程度加大,從而在一定程度上加重了氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)展。經(jīng)過(guò)DDAH 干預(yù)后,血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透程度有所下降,細(xì)胞的通透性得到修復(fù),內(nèi)膜增厚,此修復(fù)的結(jié)果使得MLCK 的蛋白表達(dá)和蛋白含量明顯下降,并能降低MLCK 的轉(zhuǎn)錄,阻止缺血再灌注肺損傷的進(jìn)一步發(fā)展,在一定程度上起到了肺保護(hù)的作用。

    本部分研究主要發(fā)現(xiàn):體外培養(yǎng)的PMVEC 在給予腦缺血-再灌注大鼠滅活的血清和外源性ADMA干預(yù)后,由于PMVEC 培養(yǎng)液中ADMA 含量增高,PKCα、MLCK 蛋白和mRNA 表達(dá)增加,細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)明顯下降。這些發(fā)現(xiàn)提示ADMA/DDAH 通路在腦缺血-再灌注損傷所致ALI 可能起著重要作用,可以作為防治缺血再灌注藥物新的潛在的干預(yù)靶點(diǎn),研究藥物干預(yù)ADMA 的生成代謝,干預(yù)ADMA/DDAH 系統(tǒng),上調(diào)DDAH 的表達(dá),抑制ADMA 的生成,因此推測(cè)藥物干預(yù)ADMA 的代謝或?qū)⑹欠乐稳毖俟嘧⒓膊?dǎo)致ALI 的一個(gè)新的治療目標(biāo)。

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