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    EPO 干預(yù)后大鼠腦缺血再灌注區(qū)域STAT1 和STAT3 蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡

    2013-03-11 08:19:50姜春娟代海洋吳文娟張追陽(yáng)
    關(guān)鍵詞:腦缺血腦組織染色

    姜春娟,許 倩,徐 凱,代海洋,吳文娟,張追陽(yáng)

    缺血性腦血管病以其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率嚴(yán)重危害人類(lèi)身心健康。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病重要的病理生理過(guò)程。我們探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)在這一過(guò)程中的作用。STATs參與細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、凋亡等生理功能的調(diào)節(jié)[1]。STATs 在腦缺血再灌注過(guò)程中被激活,以其磷酸化的形式(phosphorylated STAT,P-STAT)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用[2]。STATs 家族包括7 種轉(zhuǎn)錄因子,但不同的STATs 在腦缺血再灌注損傷中起到不同的作用,腦缺血再灌注損傷可以激活STAT1、STAT3。STAT1 與腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān),其作用機(jī)制包括誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和激活其他細(xì)胞死亡基因等。STAT3 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子與腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)[3]。

    研究表明,EPO 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)和抗凋亡的雙重作用[4]。EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)在動(dòng)物腦缺血模型、機(jī)械性損傷、刺激性毒性損傷、神經(jīng)炎和1,2,3,6-tetrahydropyridine 誘導(dǎo)的老鼠的帕金森病中所證實(shí)[5]。而Kretz 等[6]發(fā)現(xiàn)EPO 發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)為STAT3。我們建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,觀察EPO 對(duì)腦缺血再灌注損傷區(qū)STAT1、STAT3 及其磷酸化水平的表達(dá)與腦梗死體積及細(xì)胞凋亡的影響。

    1 材料和方法

    1.1 研究對(duì)象 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠120 只,體重300~330g,由江蘇省徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物完全隨機(jī)分為4 組,分別為A 假手術(shù)組、B 單純腦缺血再灌注組、C 腦缺血再灌注+生理鹽水組和D 腦缺血再灌注+EPO 組,每組30只動(dòng)物,B、C、D 組均缺血2h 和再灌注24h。

    1.2 主要試劑 TTC 染色試劑盒購(gòu)自Biosharp 公司,Western blot 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Upstate Biotechnology,Inc,免疫組織化學(xué)STAT1 抗體及磷酸化STAT1 抗體購(gòu)自Bioworld Technology 公司,STAT3 抗體及磷酸化STAT3 抗體購(gòu)自Cell Signalling 公司,原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL)購(gòu)自美國(guó)羅氏公司,重組人促紅細(xì)胞生成素注射液購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限公司。

    1.3 動(dòng)物模型制備 采用改良的Longa 法[7]將SD 大鼠制成一側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型。用10%水合氯醛(30mg/kg)麻醉大鼠,頸部正中切口,手術(shù)顯微鏡下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,在距頸總動(dòng)脈0.8~1.0cm 處結(jié)扎頸外動(dòng)脈,將處理過(guò)的線栓從小口分叉處輕輕推入頸內(nèi)動(dòng)脈,當(dāng)線插入距頸總動(dòng)脈分叉17.5~18.5mm 處并有輕微阻力時(shí),表示線已經(jīng)插入Willie’s 環(huán)大腦中動(dòng)脈起始部,阻塞了大腦中動(dòng)脈主干的血流,活結(jié)結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)的線栓。術(shù)后切口縫合包扎,大鼠放回籠內(nèi)給予食物及水源,用燈泡保持大鼠體溫在37℃左右。2h 時(shí)拔線,再灌注24h 時(shí)進(jìn)行后處理。假手術(shù)組將線栓插入5mm,其余步驟同腦缺血再灌注組。D 組于腦缺血?jiǎng)傞_(kāi)始時(shí)腹腔注射EPO(5000IU/kg),C 組腹腔注射等量0.9%生理鹽水。

    1.4 TTC 染色 各組動(dòng)物缺血2h 再灌注24h后立即斷頭取腦,于-20℃冰箱中速凍20min,冠狀位切成2mm 厚的切片,置于2% 的TTC 溶液中,37℃避光染色30min,每隔5min 翻動(dòng)腦片使均勻接觸到染色液,4%多聚甲醛固定24h。染色后,正常腦組織呈鮮紅色,梗死腦組織呈白色。數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī),用病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算測(cè)量TTC 失染區(qū)體積。為了降低因腦水腫所產(chǎn)生的誤差,通過(guò)以下公式進(jìn)行校正,梗死體積=對(duì)側(cè)半球體積-梗死側(cè)正常腦組織體積。

    1.5 Western blot 分析 大鼠斷頭取腦,迅速分離缺血區(qū)腦組織,抽提并測(cè)量蛋白,等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后,以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC 膜上,用新鮮配制的含3%脫脂奶粉的PBS液封閉,將STAT1 兔多克隆抗體(1∶500)、P-STAT1兔多克隆抗體(1∶500)、STAT3 兔多克隆抗體(1∶1000)、P-STAT3 兔多克隆抗體(1∶1000)及βactin 抗體(1∶1000)稀釋在新鮮配制的含3%脫脂奶粉的PBS 液中,4℃過(guò)夜后,加入相應(yīng)的二抗。以NBT-BCIP 顯色,結(jié)果以Image J 圖像分析軟件分析條帶,測(cè)相對(duì)灰度值(rOD),計(jì)算公式為相對(duì)灰度值(rOD)=缺血的ROI 的OD 值/假手術(shù)組OD 值。

    1.6 免疫組織化學(xué)染色(SP 法)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,在檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波修復(fù)10~15min,自然冷卻至室溫,PBS 洗3 次,3%過(guò)氧化氫37℃孵育10min 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS 沖洗3 次,滴加正常山羊血清封閉抗原25min,加入STAT3 抗體(1∶100)、P-STAT3 抗體(1∶50),4℃孵育過(guò)夜,PBS 沖洗3 次,滴加生物素標(biāo)記羊抗兔37℃孵育25min,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用0.01mol/L PBS 代替一抗。光鏡下觀察,以胞漿或胞核染成棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

    1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,大鼠腦組織固定后,用proteinase K工作液處理組織,加入TUNEl 反應(yīng)混合物暗濕盒中37℃反應(yīng)1h,然后加入POD 37℃暗濕盒中反應(yīng)30min,最后加入DAB 顯色及在蘇木素中復(fù)染。取4 張切片,每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野(×400),計(jì)算每mm2內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的核數(shù)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),多個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間比較采用SNK 法,采用雙側(cè)檢驗(yàn)作為判定標(biāo)準(zhǔn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TTC 染色顯示腦缺血再灌注后腦梗死體積變化情況 A 組可見(jiàn)到兩側(cè)大腦半球呈均勻一致紅染;B、C、D 組于左側(cè)大腦半球左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)可見(jiàn)大小不等梗死灶。B 組及C 組于左側(cè)大腦半球皮質(zhì)及紋狀體均可見(jiàn)大片狀腦缺血失染區(qū)呈白色,其梗死體積分別為287±22mm3、291±27mm3。D組左側(cè)大腦半球僅皮質(zhì)處可見(jiàn)斑片狀失染區(qū),其梗死體積為151±24mm3,與B、C 組相比,EPO 組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05),B 組和C 組比較失染區(qū)體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

    2.2 EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注損傷區(qū)域STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3 表達(dá)情況 Western blot 結(jié)果顯示STAT1 蛋白表達(dá)在4 組中的rOD值分別為2.07±0.18、1.99±0.12、2.00±0.20、1.94±0.23,組間比較結(jié)果顯示4 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.806,P>0.05);同樣,STAT3 蛋白表達(dá)在4 組中的rOD 值分別為:1.99±0.14、2.03±0.13、2.05±0.14、1.92±0.11,組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.558,P>0.05),這表明STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達(dá),且缺血2h 再灌注24h 及EPO 干預(yù)后對(duì)二者表達(dá)水平均無(wú)顯著影響。而P-STAT1、P-STAT3 在正常腦組織中表達(dá)較低,腦缺血再灌注后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達(dá)增加,EPO 干預(yù)后,與B、C 組比較,D 組的P-STAT3 表達(dá)明顯增加(F=40.719,P<0.05),P-STAT1 表達(dá)有所減少(F=3.274,P>0.05),B 組與C 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

    表1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3表達(dá)rOD 值及凋亡細(xì)胞數(shù)(n=30,±s)

    表1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3表達(dá)rOD 值及凋亡細(xì)胞數(shù)(n=30,±s)

    與B 組比較* P<0.05;與C 組比較#P<0.05

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞呈棕褐色著色,缺血再灌注及EPO 干預(yù)的STAT1、STAT3蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。在正常腦組織中可見(jiàn)少量P-STAT1、P-STAT3 免疫陽(yáng)性細(xì)胞,腦缺血再灌注后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達(dá)增加,EPO 干預(yù)后,與B、C 組比較,D 組的P-STAT3 陽(yáng)性表達(dá)明顯增加,P-STAT1 表達(dá)有所減少??傮w而言,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與Western blot 結(jié)果呈一致性。

    2.3 EPO 對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷區(qū)域細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組見(jiàn)個(gè)別散在凋亡細(xì)胞,凋亡細(xì)胞數(shù)為30±18/mm3,腦缺血再灌注組及生理鹽水組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕色或棕褐色著染,核形呈碎點(diǎn)狀,不規(guī)則,大小不一,凋亡細(xì)胞數(shù)分別為423±23/mm3、412±35/mm3。EPO 組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少,其凋亡細(xì)胞數(shù)為239±29/mm3,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理D 組與B、C 組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B 組與C 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

    3 討論

    STATs 蛋白的表達(dá)在神經(jīng)元的存活中起到重要作用,腦缺血再灌注后可以激活STAT1、STAT3,但同時(shí)觀察EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注損傷區(qū)域STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3 4 種蛋白表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型,研究該損傷區(qū)域JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STATs 蛋白表達(dá)與腦梗死體積及細(xì)胞凋亡數(shù)目的變化。

    腦缺血造成的神經(jīng)元死亡(neuronal death)可分為壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種。大量實(shí)驗(yàn)報(bào)道,神經(jīng)元壞死主要發(fā)生于缺血嚴(yán)重的核心區(qū),而凋亡則多發(fā)生于缺血的周邊區(qū)和腦內(nèi)某些缺血易感部位。神經(jīng)元缺血性壞死難于逆轉(zhuǎn),然而凋亡可通過(guò)對(duì)其上游信號(hào)的調(diào)節(jié)進(jìn)行干預(yù),腦缺血治療策略正是以這些壞死邊緣的凋亡細(xì)胞為目標(biāo)進(jìn)行的[8,9]。研究表明,STAT1 通過(guò)轉(zhuǎn)錄依賴(lài)性及非依賴(lài)性途徑在促進(jìn)細(xì)胞凋亡過(guò)程中有重要的作用[10]。而STAT3 的激活可以通過(guò)抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮腦保護(hù)作用。

    3.1 EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注區(qū)域STAT1、PSTAT1、STAT3 及P-STAT3 變化 本研究利用Western blot 和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)方法,結(jié)果顯示STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達(dá),而PSTAT1、P-STAT3 在正常腦組織中蛋白表達(dá)和免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞均較低,說(shuō)明在正常生理狀態(tài)下腦組織中STAT1、STAT3 是以無(wú)活性的非磷酸化形式存在的。腦缺血再灌注損傷后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明腦缺血再灌注時(shí)STAT1、STAT3 被激活。本實(shí)驗(yàn)Western blot 和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示EPO 干預(yù)后,P-STAT3 蛋白表達(dá)和免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步明顯增加,而P-STAT1 表達(dá)有所減少,說(shuō)明EPO 可促進(jìn)JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STAT3的磷酸化和活化。Kretz 等[6]發(fā)現(xiàn)EPO 發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)為STAT3,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EPO 干預(yù)后P-STAT1 表達(dá)水平有所降低,結(jié)合之前研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示應(yīng)用EPO 后可促進(jìn)P-STAT3 的活化,激活的P-STAT3 的表達(dá)增加在一定程度上可能降低了P-STAT1 的激活,說(shuō)明STAT1 與STAT3 之間可能存在一定的相互作用機(jī)制。我們推測(cè)可能有兩方面原因,一方面可能與EPO 激活STAT3 有關(guān),活化的STAT3 可能上調(diào)SOCS3 基因[11,12],對(duì)STAT1 的表達(dá)起到了一定的抑制作用;另一方面,STAT1 與STAT3可能競(jìng)爭(zhēng)相同的受體,活化的STAT3 能夠代替STAT1促使特定的IFN-γ 依賴(lài)性基因的轉(zhuǎn)錄,從而活化的STAT3 能夠?qū)笽FN-γ 介導(dǎo)STAT1 活化所引起的凋亡。

    3.2 EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注區(qū)域P-STAT1、P-STAT3 激活與腦梗死體積及細(xì)胞凋亡的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EPO 干預(yù)后,TTC 染色所示大鼠腦梗死體積較未干預(yù)組明顯縮小,Western blot 及免疫組織化學(xué)染色顯示P-STAT3 表達(dá)明顯增加,P-STAT1表達(dá)水平有所降低,TUNEL 染色顯示凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少,以上結(jié)果提示EPO 可促進(jìn)JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STAT3 的磷酸化和活化,而P-STAT3的激活可挽救腦缺血再灌注損傷區(qū)域中細(xì)胞的凋亡,減少其凋亡的數(shù)量,從而促進(jìn)損傷修復(fù),縮小梗死區(qū)。同時(shí)也表明P-STAT1 表達(dá)的降低有助于阻止腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損的惡化,減少細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果與Li 等[13]發(fā)現(xiàn)在小鼠持續(xù)性局灶性腦缺血模型缺血前30min 和缺血后24h 腹腔注射大劑量EPO(5000IU/kg)可使腦梗死體積明顯縮小,和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等結(jié)論相一致。

    綜上所述,本研究經(jīng)腹腔注射EPO 后,大鼠腦梗死體積明顯縮小,TUNEL 檢測(cè)結(jié)果證實(shí)腦缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少,其保護(hù)作用可能與EPO 干預(yù)后促進(jìn)P-STAT3 表達(dá)的增加及一定程度上抑制P-STAT1 的表達(dá)有關(guān)。但對(duì)于EPO發(fā)揮腦保護(hù)作用的確切生物學(xué)作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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