• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    EPO 干預(yù)后大鼠腦缺血再灌注區(qū)域STAT1 和STAT3 蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡

    2013-03-11 08:19:50姜春娟代海洋吳文娟張追陽(yáng)
    關(guān)鍵詞:腦缺血腦組織染色

    姜春娟,許 倩,徐 凱,代海洋,吳文娟,張追陽(yáng)

    缺血性腦血管病以其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率嚴(yán)重危害人類(lèi)身心健康。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病重要的病理生理過(guò)程。我們探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)在這一過(guò)程中的作用。STATs參與細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、凋亡等生理功能的調(diào)節(jié)[1]。STATs 在腦缺血再灌注過(guò)程中被激活,以其磷酸化的形式(phosphorylated STAT,P-STAT)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用[2]。STATs 家族包括7 種轉(zhuǎn)錄因子,但不同的STATs 在腦缺血再灌注損傷中起到不同的作用,腦缺血再灌注損傷可以激活STAT1、STAT3。STAT1 與腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān),其作用機(jī)制包括誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和激活其他細(xì)胞死亡基因等。STAT3 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子與腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)[3]。

    研究表明,EPO 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)和抗凋亡的雙重作用[4]。EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)在動(dòng)物腦缺血模型、機(jī)械性損傷、刺激性毒性損傷、神經(jīng)炎和1,2,3,6-tetrahydropyridine 誘導(dǎo)的老鼠的帕金森病中所證實(shí)[5]。而Kretz 等[6]發(fā)現(xiàn)EPO 發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)為STAT3。我們建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,觀察EPO 對(duì)腦缺血再灌注損傷區(qū)STAT1、STAT3 及其磷酸化水平的表達(dá)與腦梗死體積及細(xì)胞凋亡的影響。

    1 材料和方法

    1.1 研究對(duì)象 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠120 只,體重300~330g,由江蘇省徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物完全隨機(jī)分為4 組,分別為A 假手術(shù)組、B 單純腦缺血再灌注組、C 腦缺血再灌注+生理鹽水組和D 腦缺血再灌注+EPO 組,每組30只動(dòng)物,B、C、D 組均缺血2h 和再灌注24h。

    1.2 主要試劑 TTC 染色試劑盒購(gòu)自Biosharp 公司,Western blot 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Upstate Biotechnology,Inc,免疫組織化學(xué)STAT1 抗體及磷酸化STAT1 抗體購(gòu)自Bioworld Technology 公司,STAT3 抗體及磷酸化STAT3 抗體購(gòu)自Cell Signalling 公司,原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL)購(gòu)自美國(guó)羅氏公司,重組人促紅細(xì)胞生成素注射液購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限公司。

    1.3 動(dòng)物模型制備 采用改良的Longa 法[7]將SD 大鼠制成一側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型。用10%水合氯醛(30mg/kg)麻醉大鼠,頸部正中切口,手術(shù)顯微鏡下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,在距頸總動(dòng)脈0.8~1.0cm 處結(jié)扎頸外動(dòng)脈,將處理過(guò)的線栓從小口分叉處輕輕推入頸內(nèi)動(dòng)脈,當(dāng)線插入距頸總動(dòng)脈分叉17.5~18.5mm 處并有輕微阻力時(shí),表示線已經(jīng)插入Willie’s 環(huán)大腦中動(dòng)脈起始部,阻塞了大腦中動(dòng)脈主干的血流,活結(jié)結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)的線栓。術(shù)后切口縫合包扎,大鼠放回籠內(nèi)給予食物及水源,用燈泡保持大鼠體溫在37℃左右。2h 時(shí)拔線,再灌注24h 時(shí)進(jìn)行后處理。假手術(shù)組將線栓插入5mm,其余步驟同腦缺血再灌注組。D 組于腦缺血?jiǎng)傞_(kāi)始時(shí)腹腔注射EPO(5000IU/kg),C 組腹腔注射等量0.9%生理鹽水。

    1.4 TTC 染色 各組動(dòng)物缺血2h 再灌注24h后立即斷頭取腦,于-20℃冰箱中速凍20min,冠狀位切成2mm 厚的切片,置于2% 的TTC 溶液中,37℃避光染色30min,每隔5min 翻動(dòng)腦片使均勻接觸到染色液,4%多聚甲醛固定24h。染色后,正常腦組織呈鮮紅色,梗死腦組織呈白色。數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī),用病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算測(cè)量TTC 失染區(qū)體積。為了降低因腦水腫所產(chǎn)生的誤差,通過(guò)以下公式進(jìn)行校正,梗死體積=對(duì)側(cè)半球體積-梗死側(cè)正常腦組織體積。

    1.5 Western blot 分析 大鼠斷頭取腦,迅速分離缺血區(qū)腦組織,抽提并測(cè)量蛋白,等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后,以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC 膜上,用新鮮配制的含3%脫脂奶粉的PBS液封閉,將STAT1 兔多克隆抗體(1∶500)、P-STAT1兔多克隆抗體(1∶500)、STAT3 兔多克隆抗體(1∶1000)、P-STAT3 兔多克隆抗體(1∶1000)及βactin 抗體(1∶1000)稀釋在新鮮配制的含3%脫脂奶粉的PBS 液中,4℃過(guò)夜后,加入相應(yīng)的二抗。以NBT-BCIP 顯色,結(jié)果以Image J 圖像分析軟件分析條帶,測(cè)相對(duì)灰度值(rOD),計(jì)算公式為相對(duì)灰度值(rOD)=缺血的ROI 的OD 值/假手術(shù)組OD 值。

    1.6 免疫組織化學(xué)染色(SP 法)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,在檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波修復(fù)10~15min,自然冷卻至室溫,PBS 洗3 次,3%過(guò)氧化氫37℃孵育10min 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS 沖洗3 次,滴加正常山羊血清封閉抗原25min,加入STAT3 抗體(1∶100)、P-STAT3 抗體(1∶50),4℃孵育過(guò)夜,PBS 沖洗3 次,滴加生物素標(biāo)記羊抗兔37℃孵育25min,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用0.01mol/L PBS 代替一抗。光鏡下觀察,以胞漿或胞核染成棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

    1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,大鼠腦組織固定后,用proteinase K工作液處理組織,加入TUNEl 反應(yīng)混合物暗濕盒中37℃反應(yīng)1h,然后加入POD 37℃暗濕盒中反應(yīng)30min,最后加入DAB 顯色及在蘇木素中復(fù)染。取4 張切片,每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野(×400),計(jì)算每mm2內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的核數(shù)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),多個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間比較采用SNK 法,采用雙側(cè)檢驗(yàn)作為判定標(biāo)準(zhǔn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TTC 染色顯示腦缺血再灌注后腦梗死體積變化情況 A 組可見(jiàn)到兩側(cè)大腦半球呈均勻一致紅染;B、C、D 組于左側(cè)大腦半球左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)可見(jiàn)大小不等梗死灶。B 組及C 組于左側(cè)大腦半球皮質(zhì)及紋狀體均可見(jiàn)大片狀腦缺血失染區(qū)呈白色,其梗死體積分別為287±22mm3、291±27mm3。D組左側(cè)大腦半球僅皮質(zhì)處可見(jiàn)斑片狀失染區(qū),其梗死體積為151±24mm3,與B、C 組相比,EPO 組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05),B 組和C 組比較失染區(qū)體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

    2.2 EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注損傷區(qū)域STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3 表達(dá)情況 Western blot 結(jié)果顯示STAT1 蛋白表達(dá)在4 組中的rOD值分別為2.07±0.18、1.99±0.12、2.00±0.20、1.94±0.23,組間比較結(jié)果顯示4 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.806,P>0.05);同樣,STAT3 蛋白表達(dá)在4 組中的rOD 值分別為:1.99±0.14、2.03±0.13、2.05±0.14、1.92±0.11,組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.558,P>0.05),這表明STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達(dá),且缺血2h 再灌注24h 及EPO 干預(yù)后對(duì)二者表達(dá)水平均無(wú)顯著影響。而P-STAT1、P-STAT3 在正常腦組織中表達(dá)較低,腦缺血再灌注后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達(dá)增加,EPO 干預(yù)后,與B、C 組比較,D 組的P-STAT3 表達(dá)明顯增加(F=40.719,P<0.05),P-STAT1 表達(dá)有所減少(F=3.274,P>0.05),B 組與C 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

    表1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3表達(dá)rOD 值及凋亡細(xì)胞數(shù)(n=30,±s)

    表1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3表達(dá)rOD 值及凋亡細(xì)胞數(shù)(n=30,±s)

    與B 組比較* P<0.05;與C 組比較#P<0.05

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞呈棕褐色著色,缺血再灌注及EPO 干預(yù)的STAT1、STAT3蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。在正常腦組織中可見(jiàn)少量P-STAT1、P-STAT3 免疫陽(yáng)性細(xì)胞,腦缺血再灌注后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達(dá)增加,EPO 干預(yù)后,與B、C 組比較,D 組的P-STAT3 陽(yáng)性表達(dá)明顯增加,P-STAT1 表達(dá)有所減少??傮w而言,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與Western blot 結(jié)果呈一致性。

    2.3 EPO 對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷區(qū)域細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組見(jiàn)個(gè)別散在凋亡細(xì)胞,凋亡細(xì)胞數(shù)為30±18/mm3,腦缺血再灌注組及生理鹽水組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕色或棕褐色著染,核形呈碎點(diǎn)狀,不規(guī)則,大小不一,凋亡細(xì)胞數(shù)分別為423±23/mm3、412±35/mm3。EPO 組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少,其凋亡細(xì)胞數(shù)為239±29/mm3,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理D 組與B、C 組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B 組與C 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

    3 討論

    STATs 蛋白的表達(dá)在神經(jīng)元的存活中起到重要作用,腦缺血再灌注后可以激活STAT1、STAT3,但同時(shí)觀察EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注損傷區(qū)域STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3 4 種蛋白表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型,研究該損傷區(qū)域JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STATs 蛋白表達(dá)與腦梗死體積及細(xì)胞凋亡數(shù)目的變化。

    腦缺血造成的神經(jīng)元死亡(neuronal death)可分為壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種。大量實(shí)驗(yàn)報(bào)道,神經(jīng)元壞死主要發(fā)生于缺血嚴(yán)重的核心區(qū),而凋亡則多發(fā)生于缺血的周邊區(qū)和腦內(nèi)某些缺血易感部位。神經(jīng)元缺血性壞死難于逆轉(zhuǎn),然而凋亡可通過(guò)對(duì)其上游信號(hào)的調(diào)節(jié)進(jìn)行干預(yù),腦缺血治療策略正是以這些壞死邊緣的凋亡細(xì)胞為目標(biāo)進(jìn)行的[8,9]。研究表明,STAT1 通過(guò)轉(zhuǎn)錄依賴(lài)性及非依賴(lài)性途徑在促進(jìn)細(xì)胞凋亡過(guò)程中有重要的作用[10]。而STAT3 的激活可以通過(guò)抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮腦保護(hù)作用。

    3.1 EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注區(qū)域STAT1、PSTAT1、STAT3 及P-STAT3 變化 本研究利用Western blot 和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)方法,結(jié)果顯示STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達(dá),而PSTAT1、P-STAT3 在正常腦組織中蛋白表達(dá)和免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞均較低,說(shuō)明在正常生理狀態(tài)下腦組織中STAT1、STAT3 是以無(wú)活性的非磷酸化形式存在的。腦缺血再灌注損傷后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明腦缺血再灌注時(shí)STAT1、STAT3 被激活。本實(shí)驗(yàn)Western blot 和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示EPO 干預(yù)后,P-STAT3 蛋白表達(dá)和免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步明顯增加,而P-STAT1 表達(dá)有所減少,說(shuō)明EPO 可促進(jìn)JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STAT3的磷酸化和活化。Kretz 等[6]發(fā)現(xiàn)EPO 發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)為STAT3,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EPO 干預(yù)后P-STAT1 表達(dá)水平有所降低,結(jié)合之前研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示應(yīng)用EPO 后可促進(jìn)P-STAT3 的活化,激活的P-STAT3 的表達(dá)增加在一定程度上可能降低了P-STAT1 的激活,說(shuō)明STAT1 與STAT3 之間可能存在一定的相互作用機(jī)制。我們推測(cè)可能有兩方面原因,一方面可能與EPO 激活STAT3 有關(guān),活化的STAT3 可能上調(diào)SOCS3 基因[11,12],對(duì)STAT1 的表達(dá)起到了一定的抑制作用;另一方面,STAT1 與STAT3可能競(jìng)爭(zhēng)相同的受體,活化的STAT3 能夠代替STAT1促使特定的IFN-γ 依賴(lài)性基因的轉(zhuǎn)錄,從而活化的STAT3 能夠?qū)笽FN-γ 介導(dǎo)STAT1 活化所引起的凋亡。

    3.2 EPO 干預(yù)后腦缺血再灌注區(qū)域P-STAT1、P-STAT3 激活與腦梗死體積及細(xì)胞凋亡的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EPO 干預(yù)后,TTC 染色所示大鼠腦梗死體積較未干預(yù)組明顯縮小,Western blot 及免疫組織化學(xué)染色顯示P-STAT3 表達(dá)明顯增加,P-STAT1表達(dá)水平有所降低,TUNEL 染色顯示凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少,以上結(jié)果提示EPO 可促進(jìn)JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STAT3 的磷酸化和活化,而P-STAT3的激活可挽救腦缺血再灌注損傷區(qū)域中細(xì)胞的凋亡,減少其凋亡的數(shù)量,從而促進(jìn)損傷修復(fù),縮小梗死區(qū)。同時(shí)也表明P-STAT1 表達(dá)的降低有助于阻止腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損的惡化,減少細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果與Li 等[13]發(fā)現(xiàn)在小鼠持續(xù)性局灶性腦缺血模型缺血前30min 和缺血后24h 腹腔注射大劑量EPO(5000IU/kg)可使腦梗死體積明顯縮小,和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等結(jié)論相一致。

    綜上所述,本研究經(jīng)腹腔注射EPO 后,大鼠腦梗死體積明顯縮小,TUNEL 檢測(cè)結(jié)果證實(shí)腦缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少,其保護(hù)作用可能與EPO 干預(yù)后促進(jìn)P-STAT3 表達(dá)的增加及一定程度上抑制P-STAT1 的表達(dá)有關(guān)。但對(duì)于EPO發(fā)揮腦保護(hù)作用的確切生物學(xué)作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

    [1]ErdaF,Trapp T,Mies G,et al.Immunohistochemical analysis of protein expression after middle cerebral artery occlusion in mice[J].Acta Neuropathol,2004,107(2):127-136.

    [2]Amantea D,Tassorelli C,Russo R,et al.Neuroprotection by leptin in a rat model of permanent cerebral ischemia:effects on STAT3 phosphorylation in discrete cells of the brain[J].Cell Death Dis,2011,2:238.

    [3]Dziennis S,Alkayed NJ.Role of signal transducer and activator of transcription 3 in neuronal survival and regeneration[J].Rev Neurosci,2008,19(4~5):341-361.

    [4]Velly L,Pellegrini L,Guillet B,et al.Erythropoietin 2nd cerebral protection after acute injuries:a double-edged sword[J].Pharmacol Ther,2010,128(3):445-459.

    [5]楊彥玲,朱文俠,陳雅慧,等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2010,26(2):152-153.

    [6]KretzA,Happold CJ,Marticke JK,et al.Erythropoietin promotes regeneration of adult CNS neurons via Jak2/Stat3 and PI3K/AKT pathway activation[J].Mol Cell Neurosci,2005,29(4):569-579.

    [7]Kisseleva T,Bhattacharya S,Braunstein J,et al.Signaling through the JAK-STAT pathway:recent advances and future challenges[J].Gene,2002,285(1):1-24.

    [8]Zechariah A,Elali A,Hermann DM.Combination of tissue-plasminogen activator with erythropoietin induces blood-brain barrier permeability,extracellular matrix disaggregation,and DNA fragmentation after focal cerebral ischemia in mice[J].Stroke,2010,41(5):1008-1012.

    [9]Ferrer I,Plans AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra[J].J Neuropatho Experi Neuro,2003,62(4):329-339.

    [10]Kim HS,Lee MS.STAT1 as a key modulator of cell death[J].Cell Signal,2007,19(3):454-465.

    [11]Lim CP,Cao X.Structure,function,and regulation of STAT proteins[J].Mol Biosyst,2006,2(11):536-550.

    [12]Qin H,Niyongere SA,Lee SJ,et al.Expression and functional significance of SOCS-1 and SOCS-3 in astrocytes[J].J Immunol,2008,181(5):3167-3176.

    [13]Li Y,Lu Z,Keogh CL,et al.Erythropoietin-induced neurovascular protection,angiogenesis,and cerebral blood flow restoration after focal ischemia in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):1043-1054.

    猜你喜歡
    腦缺血腦組織染色
    小腦組織壓片快速制作在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    芒果苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦組織炎癥損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    平面圖的3-hued 染色
    簡(jiǎn)單圖mC4的點(diǎn)可區(qū)別V-全染色
    油紅O染色在斑馬魚(yú)體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    原花青素對(duì)腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用
    DNA雙加氧酶TET2在老年癡呆動(dòng)物模型腦組織中的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激中神經(jīng)元的保護(hù)作用
    血必凈對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
    細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探
    2,4-二氯苯氧乙酸對(duì)子代大鼠發(fā)育及腦組織的氧化損傷作用
    美女福利国产在线| 国产成人啪精品午夜网站| www.自偷自拍.com| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品一区在线观看国产| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品一区二区三卡| 91成人精品电影| 国产在线一区二区三区精| 亚洲三区欧美一区| 色播在线永久视频| 黑人猛操日本美女一级片| tocl精华| 高清黄色对白视频在线免费看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 婷婷成人精品国产| 亚洲av片天天在线观看| 午夜激情久久久久久久| a级毛片在线看网站| 精品乱码久久久久久99久播| 老熟妇仑乱视频hdxx| 老司机影院成人| 夫妻午夜视频| 男人操女人黄网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品一品国产午夜福利视频| 不卡一级毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 午夜免费成人在线视频| 女性被躁到高潮视频| 午夜免费鲁丝| 在线av久久热| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲中文av在线| 一个人免费看片子| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久精品国产综合久久久| 久久久国产一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久久久国内视频| 亚洲国产精品999| 国产成人欧美| 丝袜美腿诱惑在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品免费大片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 最近最新免费中文字幕在线| 最近中文字幕2019免费版| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 不卡一级毛片| 99热全是精品| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美日韩精品网址| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 窝窝影院91人妻| 免费av中文字幕在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 免费高清在线观看日韩| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利视频精品| 午夜免费鲁丝| 2018国产大陆天天弄谢| 极品人妻少妇av视频| 人成视频在线观看免费观看| 美女高潮到喷水免费观看| avwww免费| 热re99久久精品国产66热6| 精品久久久精品久久久| 窝窝影院91人妻| 青春草亚洲视频在线观看| av网站在线播放免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日本vs欧美在线观看视频| 一本色道久久久久久精品综合| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美在线一区亚洲| 在线天堂中文资源库| 欧美变态另类bdsm刘玥| 丁香六月天网| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产av国产精品国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 香蕉丝袜av| 人妻一区二区av| 亚洲,欧美精品.| 国产伦理片在线播放av一区| 五月开心婷婷网| 美女中出高潮动态图| 久久久久久久国产电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲成人手机| 色视频在线一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99热网站在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人精品在线电影| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产又爽黄色视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 蜜桃国产av成人99| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜老司机福利片| 国产色视频综合| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久精品人人爽人人爽视色| 深夜精品福利| 国产一卡二卡三卡精品| avwww免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 不卡一级毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 搡老乐熟女国产| 久久ye,这里只有精品| 少妇的丰满在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品少妇久久久久久888优播| 久久热在线av| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久99一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 中文字幕色久视频| av一本久久久久| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 一区二区三区激情视频| 久久九九热精品免费| 亚洲五月婷婷丁香| 国产黄频视频在线观看| 青草久久国产| 久久女婷五月综合色啪小说| 一二三四社区在线视频社区8| 女性生殖器流出的白浆| 最近最新中文字幕大全免费视频| 午夜福利在线观看吧| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 91老司机精品| 成人三级做爰电影| 久久久国产成人免费| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜福利,免费看| 欧美日本中文国产一区发布| 成人免费观看视频高清| 国产男女超爽视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产成人精品无人区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产黄色免费在线视频| 男人操女人黄网站| 一进一出抽搐动态| 女人精品久久久久毛片| 婷婷丁香在线五月| 国产成人啪精品午夜网站| 又黄又粗又硬又大视频| 老司机在亚洲福利影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美 日韩 精品 国产| av线在线观看网站| 日韩电影二区| 久久久国产精品麻豆| 国产伦人伦偷精品视频| 久久人妻熟女aⅴ| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久国内视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久国产成人免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩有码中文字幕| 国产一区二区在线观看av| 亚洲国产av新网站| 成人国语在线视频| 国产男女内射视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 91大片在线观看| 我的亚洲天堂| 精品高清国产在线一区| 午夜福利影视在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99热全是精品| 亚洲中文字幕日韩| 欧美+亚洲+日韩+国产| 考比视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 中文欧美无线码| 国产一区二区三区av在线| 最黄视频免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 国产日韩欧美在线精品| av在线app专区| 国产日韩欧美在线精品| 国产不卡av网站在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲精品自拍成人| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久视频综合| 久久精品成人免费网站| 两性夫妻黄色片| 三级毛片av免费| 一级片'在线观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品人妻1区二区| 在线观看一区二区三区激情| 欧美精品高潮呻吟av久久| 青春草视频在线免费观看| 久久久久精品人妻al黑| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| av网站免费在线观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 91大片在线观看| 女性被躁到高潮视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 好男人电影高清在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产区一区二久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久国产精品影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久性视频一级片| 中文字幕色久视频| 91九色精品人成在线观看| 久久久久久人人人人人| 久热这里只有精品99| 国产福利在线免费观看视频| 麻豆国产av国片精品| 亚洲免费av在线视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 最近中文字幕2019免费版| 精品久久久久久电影网| 不卡av一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美一级毛片孕妇| 我要看黄色一级片免费的| 日韩一区二区三区影片| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 日本欧美视频一区| 久久人妻熟女aⅴ| 男人操女人黄网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日日夜夜操网爽| 欧美性长视频在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 成年人免费黄色播放视频| 交换朋友夫妻互换小说| av片东京热男人的天堂| 久久青草综合色| 欧美成人午夜精品| 精品人妻在线不人妻| 在线天堂中文资源库| 中亚洲国语对白在线视频| 国产成人欧美在线观看 | 91成人精品电影| 五月开心婷婷网| 青草久久国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| av不卡在线播放| 欧美日韩黄片免| 午夜影院在线不卡| 久久久久精品人妻al黑| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 下体分泌物呈黄色| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 永久免费av网站大全| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 99久久综合免费| 国产视频一区二区在线看| 亚洲 国产 在线| 国产主播在线观看一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲国产av新网站| 丁香六月欧美| 欧美 日韩 精品 国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 成在线人永久免费视频| 国产av又大| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美乱码精品一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲欧美色中文字幕在线| 色94色欧美一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| av一本久久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 十八禁高潮呻吟视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产真人三级小视频在线观看| 国产av精品麻豆| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 性色av乱码一区二区三区2| 最黄视频免费看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 国产免费现黄频在线看| 国产区一区二久久| 窝窝影院91人妻| 国产精品久久久久久精品古装| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲七黄色美女视频| e午夜精品久久久久久久| 中文字幕av电影在线播放| 国产亚洲一区二区精品| 精品一区二区三卡| 母亲3免费完整高清在线观看| 操出白浆在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 中文字幕高清在线视频| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 大香蕉久久成人网| av国产精品久久久久影院| 欧美国产精品va在线观看不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一卡二卡三卡精品| 99国产精品免费福利视频| 天天添夜夜摸| av又黄又爽大尺度在线免费看| av电影中文网址| 欧美在线黄色| 电影成人av| 久久综合国产亚洲精品| 蜜桃国产av成人99| 久热这里只有精品99| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产男人的电影天堂91| 色老头精品视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| bbb黄色大片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品高清国产在线一区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久国产精品麻豆| www.精华液| 99久久人妻综合| 1024视频免费在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲第一青青草原| 国产区一区二久久| 热re99久久精品国产66热6| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 俄罗斯特黄特色一大片| 成人影院久久| 天天影视国产精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | cao死你这个sao货| 真人做人爱边吃奶动态| 在线永久观看黄色视频| 精品久久久久久电影网| 欧美日韩黄片免| 69av精品久久久久久 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 97在线人人人人妻| 日本wwww免费看| 亚洲专区中文字幕在线| 日本vs欧美在线观看视频| 十八禁高潮呻吟视频| 两人在一起打扑克的视频| 国产野战对白在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜影院在线不卡| 国产精品欧美亚洲77777| 国产免费av片在线观看野外av| av一本久久久久| 亚洲视频免费观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 日韩三级视频一区二区三区| 丁香六月欧美| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲欧美清纯卡通| 啪啪无遮挡十八禁网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美 日韩 精品 国产| 女警被强在线播放| 午夜福利视频在线观看免费| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久综合国产亚洲精品| 女性生殖器流出的白浆| 午夜福利影视在线免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产色视频综合| 欧美日韩亚洲高清精品| 99热网站在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄色视频不卡| 人妻人人澡人人爽人人| 69av精品久久久久久 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 我的亚洲天堂| 午夜福利在线免费观看网站| 我要看黄色一级片免费的| 永久免费av网站大全| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人免费观看mmmm| 精品一品国产午夜福利视频| 9色porny在线观看| 午夜福利免费观看在线| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 夫妻午夜视频| 亚洲男人天堂网一区| 一级毛片精品| 黄频高清免费视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 18禁观看日本| 青草久久国产| 欧美成人午夜精品| 中国美女看黄片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久香蕉激情| 日本91视频免费播放| 亚洲综合色网址| 久久天堂一区二区三区四区| 一级毛片精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 考比视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 91精品三级在线观看| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲三区欧美一区| 一进一出抽搐动态| 日韩视频在线欧美| 91老司机精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av线在线观看网站| 国产成人啪精品午夜网站| 国产一卡二卡三卡精品| 男男h啪啪无遮挡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩有码中文字幕| 欧美精品高潮呻吟av久久| 女人精品久久久久毛片| 国产野战对白在线观看| 夫妻午夜视频| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产黄色免费在线视频| 韩国精品一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产日韩一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品一区蜜桃| 精品一区在线观看国产| 女性生殖器流出的白浆| 丝袜脚勾引网站| 麻豆国产av国片精品| 波多野结衣av一区二区av| 精品一区在线观看国产| 色94色欧美一区二区| 手机成人av网站| 亚洲美女黄色视频免费看| 男女午夜视频在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 天天添夜夜摸| 秋霞在线观看毛片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 午夜免费观看性视频| 国精品久久久久久国模美| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 啦啦啦免费观看视频1| 丰满迷人的少妇在线观看| 天天添夜夜摸| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av男天堂| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品国产国语对白av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 嫩草影视91久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 岛国毛片在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日日夜夜操网爽| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| av有码第一页| av免费在线观看网站| 国产成人av教育| 人妻 亚洲 视频| 国产成人a∨麻豆精品| 一级片免费观看大全| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品免费大片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲av男天堂| 亚洲,欧美精品.| 日韩免费高清中文字幕av| 国产黄频视频在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本a在线网址| 999精品在线视频| bbb黄色大片| avwww免费| 在线观看免费高清a一片| a级毛片在线看网站| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人精品在线电影| 国产亚洲av高清不卡| 十分钟在线观看高清视频www| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产精品久久久久成人av| 亚洲天堂av无毛| 久久国产精品男人的天堂亚洲| av在线播放精品| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产色视频综合| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产av国产精品国产| a级毛片在线看网站| 亚洲少妇的诱惑av| 黄片播放在线免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 999久久久国产精品视频| 精品一区在线观看国产| 久久中文字幕一级| 999精品在线视频| 国产激情久久老熟女| 99国产精品免费福利视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 超色免费av| 国产精品久久久av美女十八| 久久青草综合色| 国产精品 国内视频| av在线app专区| 黄色a级毛片大全视频| 欧美精品一区二区大全| 嫩草影视91久久| 两个人看的免费小视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 自线自在国产av| 亚洲国产精品一区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 嫩草影视91久久| 两个人看的免费小视频| 男女下面插进去视频免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 高清av免费在线| 亚洲久久久国产精品| 久久精品国产综合久久久| 超色免费av| 国产xxxxx性猛交| 国产成人免费无遮挡视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 午夜影院在线不卡| 美女福利国产在线| 一区二区三区精品91| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品国产一区二区精华液| 在线精品无人区一区二区三| 97人妻天天添夜夜摸|